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diguoxueye金蟲 (正式寫手)
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[交流]
關(guān)于果蔬中過氧化物酶與過氧化氫酶活力測定 已有1人參與
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我在做POD和CAT酶活力測定時發(fā)現(xiàn)了一些異常現(xiàn)象。我是采用測吸光值測定結(jié)果的。發(fā)現(xiàn)吸光值呈現(xiàn)異常變化情況。比如測CAT時發(fā)現(xiàn)，有的吸光值不斷的下降，有的樣品的吸光值先在測定的最初1min內(nèi)急劇下降，隨后，有的是下降速度明顯降低，有的是呈增加的趨勢。還有的樣品是吸光值在前1分鐘內(nèi)先升高，隨后，呈現(xiàn)規(guī)律的下降趨勢。測定POD也出現(xiàn)了同樣的問題。但是，以前測定POD的時候，曲線的R平方值非常大，基本上都是0.99以上的�，F(xiàn)在和以前的最大差別在于，兩次的樣品不同，但是都屬于同一個品種，現(xiàn)在測定的酶活比以前測定的小很多。 補充一點：我的分離方式采用的是過濾，而不是離心。主要是因為發(fā)現(xiàn)離心的效果比較差，又沒有高速離心機。最后發(fā)現(xiàn)過濾的溶液還是比較澄清的。 下面的是POD的測定方法 7、過氧化物酶活力測定 (1) 試劑 0.02mol/L KH2PO4溶液，0.1molPH6.0磷酸緩沖液，反應(yīng)混合液（取0.1mol/LPH6.0磷酸緩沖液50mL，加入愈創(chuàng)木酚0.028mL，于磁力攪拌器加熱攪拌至溶解，待溶液冷卻后，加入30%過氧化氫0.019mL，混合均勻，于冰箱中保存）。 (2) 試驗方法 a) 粗酶液的提�。悍Q取1.0g植物組織，放入研缽中，加入少量石英砂和0.02mol/L KH2PO4溶液5mL，冰浴研磨成勻漿，于4000r/min下離心15min，上清液轉(zhuǎn)入25mL容量瓶中。所剩沉淀再用5mL0.02mol/L KH2PO4溶液提取一次，上清液并入容量瓶，定容至25mL，保存在冰箱備用。 b) POD測定：取比色杯2只，一只加入反應(yīng)混合液3mL和0.02mol/L KH2PO4溶液1mL，作為調(diào)零空白；另一只加入反應(yīng)混合液3mL和上述粗酶液1mL（如酶活力過高可稀釋），立即開啟秒表計時，于分光光度計470nm處比色測定吸光度，每隔1min讀數(shù)一次。 c) 結(jié)果計算：以每分鐘內(nèi)OD470變化0.01為1個POD活力單位，計算活力： POD活力（U/gFW/min）= 式中：△OD470——反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化量； W——植物組織鮮重（g）； t——反應(yīng)時間（min）； Vt——提取酶液總體積（mL）； Vs——測定時取用酶液體積（mL）。 CAT測定采用 樣品提取是采用的磷酸鹽緩沖液，測定吸光值時，2.9mLTris-HCl緩沖液+0.05mL750mmol/L過氧化氫+0.05mol/L粗酶液，在240nm下測定吸光值。每30s測定一次吸光值。 |
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