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fairyjsj銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
DGGE上樣量以及數(shù)據(jù)分析相關(guān)問題 已有2人參與
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最近在用DGGE檢測小鼠糞便的微生物種類的變化，8%的變性膠，濃度梯度在35%-55%，利用TAKARA的primeSTAR Max premix來擴增微生物的V3可變區(qū)片段，第一次跑不知道上樣量多少合適就取了20ul上樣，結(jié)果85V，跑了17個小時，結(jié)果如圖： 現(xiàn)在我覺得自己存在問題有一下幾點，還請各位經(jīng)驗滿滿的蟲友們給點意見： （1）上樣量一直是我糾結(jié)的問題，因為跑膠后會針對條帶進行分析，所以上樣前是否需要對PCR產(chǎn)物進行濃度測定，以此保證每個孔的上樣量是一致的。抑或者保證PCR時模板的含量都是一樣的，擴增同樣的同樣的循環(huán)數(shù)后，取同樣量的PCR產(chǎn)物上樣就好了？ （2）制膠的問題，第一次跑我沒有上濃縮膠，全部都是分離膠。我的板子是16X16的biorad的膠，上樣時按照說明把刻度調(diào)到14.5，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射器里的膠全部推入膠板后就沒有空間灌濃縮膠，我是不是哪里弄錯了。 （3）關(guān)于跑膠的時間和電壓及電流，我找到了好多protocol，跑膠的電壓和時間都不相同，我這次用的是85V，20mA，跑了17個小時還沒有跑到底，由于是第一次跑覺得肯定難看就拆了板做了銀染走了一下流程。大家能否給我個比較常用的跑膠條件。 （4）分析軟件，從bio-rad的官網(wǎng)下了quantity One，但都是basic的，瓊脂糖凝膠電泳的圖都無法放進去分析，有沒有蟲友可以介紹一下其他的比較好用的分析軟件。 以上幾個問題，小女子跪求各位蟲友給點建議，萬分感激！謝謝各位了！ IMG_0974.JPG |
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2樓2015-03-22 16:59:44
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