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nrcy1987新蟲 (初入文壇)
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[求助]
提過蛋白的大牛快請進�。� 已有2人參與
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| 蛋白大牛們，想請教一個小問題~ 我提了protein打算做EMSA，如果我提的protein是個dimer，那么在buffer里蛋白可能有monomer狀態(tài)的么？多謝了�。。。ㄎ业膃msa結(jié)果顯示，被蛋白binding的DNA有4條帶，但是DNase I footprinting顯示被binding的DNA序列只可能bind一個protein dimer，所以會不會有單體狀態(tài)的protein結(jié)合到了DNA上？這樣的話，有dimer和monomer分別bind到DNA上，所以形成了4條帶？） |
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張解放88
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
nrcy1987: 金幣+4, ★★★很有幫助 2014-12-30 10:29:33
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nrcy1987: 金幣+4, ★★★很有幫助 2014-12-30 10:29:33
| 我之前做蛋白的，首先先回答你的一個問題，buffer里蛋白肯定有monomer狀態(tài)的，只是量多量少；第二，最為關(guān)鍵的您的是什么蛋白質(zhì)？有的是四聚體，有的是二聚體，但是由于你在純化或者其他手段處理的過程中，會影響蛋白質(zhì)的unfolding and refolding；第三，你說的幾條帶可以根據(jù)DNase I footprinting顯示亮度來判斷。dimer bind到DNA上應(yīng)該是最亮的，其他弱；第四;假陽性存在，自己猜資料解決。 |
2樓2014-12-29 19:28:47
凌波麗
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3樓2014-12-30 00:11:01
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【答案】應(yīng)助回帖
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怎么用分子篩層析獲得次級鍵締合的蛋白質(zhì)請見： 確定蛋白質(zhì)—多肽相互作用結(jié)合位點的實驗設(shè)計凌波麗個人總結(jié)之二 & 回答小雨莎莎的提問(總體思路與研究方法) http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=6739957 |
4樓2014-12-30 00:14:16
nrcy1987
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感謝你的回復(fù)！我這個protein是用cross-linking確定的是個dimer，是初步確定。我做的DNase I footprinting結(jié)果顯示有50bp的DNA被binding，是一個整個的region。但是EMSA結(jié)果永遠是很清晰的4條帶。不知該如何解釋。。。被binding的50bp的中間是一個反向互補序列（估計一個dimer結(jié)合在此），但在這個反向互補序列兩邊還分別有十幾個bp也是被binding的。請問，兩端的這個沒有什么規(guī)律的序列是不是非特異性的結(jié)合上了蛋白（dimer或者monomer）？多謝了�。�！ |
5樓2014-12-30 10:36:49
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【答案】應(yīng)助回帖
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三點提示： 1.DNA與蛋白質(zhì)相互作用的直接作用區(qū)域最好的確定方法是ChIP，而且ChIP能夠在細胞原位上偵測出DNA-蛋白質(zhì)的特異性的結(jié)合位點。因為DNase I footprinting因為蛋白質(zhì)的體積比較大，影響了酶切，所以精確的作用位點不好確定。 2.不知道你的蛋白質(zhì)亞基之間的交聯(lián)劑是什么，有些交聯(lián)劑有手臂，加上起反應(yīng)的緩沖溶液條件，可能會撐開不同的亞基或者多交連一些亞基（后者比如戊二醛）。我建議還是先使用分子篩層析，在接近生理條件下檢測蛋白質(zhì)的亞基構(gòu)成，并且分離出來。 3.凝膠阻滯電泳中可能有新的結(jié)合蛋白質(zhì)的序列，這不奇怪，因為蛋白質(zhì)在細胞中一般與DNA可能有特異性的結(jié)合序列，也同時會有一些非特異性的結(jié)合序列，兩者結(jié)合力不同，而且有時還與其他的蛋白質(zhì)的調(diào)控有關(guān)。 |
6樓2014-12-30 11:12:51
凌波麗
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7樓2014-12-30 11:16:39
only314
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8樓2020-05-13 11:25:36
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