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[求助] 普通PCR和qPCR遇到問(wèn)題，求助已有2人參與

各位大神，我最近在做植物基因，遇到費(fèi)解的問(wèn)題了，求助呀！
提出的RNA跑膠驗(yàn)證條帶良好，隨之進(jìn)行RT-PCR。用得到的cDNA產(chǎn)物先做了一下Actin的普通PCR，結(jié)果屢次不出結(jié)果。RNA和cDNA的濃度都挺高的，請(qǐng)問(wèn)這是什么情況？哪里出問(wèn)題了？我也嘗試了用這些cDNA模板去做qPCR，結(jié)果Actin的出峰也不理想，總是有嚴(yán)重的雜峰。按說(shuō)Actin不應(yīng)該出現(xiàn)這種情況啊！

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1樓 2015-01-04 09:16:19

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王平陽(yáng)

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myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-04 13:19:49

兩個(gè)原因：
1、cDNA反轉(zhuǎn)錄有問(wèn)題，如果反轉(zhuǎn)錄沒(méi)有成功就擴(kuò)增不出產(chǎn)物；
2、Actin引物問(wèn)題，建議排查此內(nèi)參引物是否適用該物種。

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沒(méi)有做不到，只有想不到！

2樓2015-01-04 10:23:46

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引用回帖:

2樓: Originally posted by 王平陽(yáng) at 2015-01-04 10:23:46
兩個(gè)原因：
1、cDNA反轉(zhuǎn)錄有問(wèn)題，如果反轉(zhuǎn)錄沒(méi)有成功就擴(kuò)增不出產(chǎn)物；
2、Actin引物問(wèn)題，建議排查此內(nèi)參引物是否適用該物種。

我做普通PCR和qPCR所用的兩種Actin引物是實(shí)驗(yàn)室的師兄師姐之前合成的，并且都做出結(jié)果了，我們做的是同一種植物。感覺(jué)應(yīng)該不是引物的問(wèn)題吧~~反轉(zhuǎn)錄不成功會(huì)有哪些方面什么原因呢？

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3樓2015-01-05 14:42:32

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阿爾卑斯英

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【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

反轉(zhuǎn)錄試劑的添加，反轉(zhuǎn)錄引物的選擇及反應(yīng)程序的設(shè)置，

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4樓2015-01-06 10:17:42

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引用回帖:

4樓: Originally posted by 阿爾卑斯英 at 2015-01-06 10:17:42
反轉(zhuǎn)錄試劑的添加，反轉(zhuǎn)錄引物的選擇及反應(yīng)程序的設(shè)置，

好吧~有可能是酶失活了吧，待驗(yàn)證中...

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5樓2015-01-06 14:32:30

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