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gumimimi新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
求問(wèn)怎樣查找比較偏門(mén)的菌類(lèi)的基因相應(yīng)的cDNA并在此基礎(chǔ)上RT-PCR設(shè)計(jì)引物，多謝 已有2人參與
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之前在網(wǎng)上查過(guò)各種利用NCBI查找cDNA、設(shè)計(jì)引物的教程，但是不知道是我的問(wèn)題還是查的不對(duì)，依然還是各種查不到 實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)會(huì)設(shè)計(jì)引物的師兄畢業(yè)了，問(wèn)了一圈都沒(méi)有特別懂的，還望各位大神相助T^T 具體如下： 想要查找的基因是hmgs（HMG-coA合酶），參考的文獻(xiàn)里cDNA的來(lái)源是Phycomyces這個(gè)菌，文獻(xiàn)里有句原文是： A fragment of hmgS was obtained by PCR using Phycomyces cDNA as template, together with a set of primers designed to anneal to conserved areas of the gene: HS-2 (5’-GGNAAATA-TACNATHGG-3’, corresponding to the amino acid sequence GKYTIG) and HS-3 (5’-AAATCRTANGCRTGYTGCAT-3’, aa sequence MQHAYDF). 文獻(xiàn)上這里的引物我沒(méi)太看懂……不過(guò)作者不是做的RT-PCR，是做的Northern。 于是我是想找到Phycomyces的hmgs對(duì)應(yīng)的cDNA序列，再來(lái)根據(jù)cDNA設(shè)計(jì)RT-PCR的引物 但是不知道該怎么找到Phycomyces的相關(guān)cDNA，在NCBI上找了下發(fā)現(xiàn)可選目錄里都沒(méi)Phycomyces這個(gè)菌T^T 然后我看到，依然是該文獻(xiàn)里，提到了這么一句： The rest of the gene was obtained by inverse PCR and sequenced to assemble a 2528-bp DNA segment containing the Phycomyces hmgS gene and its flanking regions (EMBL Accession No. AJ297414). 于是我想查一下EMBL試試，但是發(fā)現(xiàn)根本進(jìn)不了這個(gè)網(wǎng)站，于是又不知道該怎么做了T^T 以上就是全部問(wèn)題，還望各位能幫忙看看還有什么查找方法，萬(wàn)分感謝T^T |
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2樓2015-01-07 21:51:09
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3樓2015-01-07 22:12:55
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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你貼出來(lái)的文獻(xiàn)其實(shí)已經(jīng)把方法說(shuō)得很清楚了，只是一些關(guān)鍵的地方你暫時(shí)還理解不了。我覺(jué)得你首先要做的不是找序列，你說(shuō)的物種沒(méi)有測(cè)序，通常情況下是沒(méi)有序列的，誰(shuí)都找不到！你要做的應(yīng)該是上百度找一些“簡(jiǎn)并引物”相關(guān)的資料，看別人是怎么設(shè)計(jì)引物的，或者到你們圖書(shū)館借一些相關(guān)的書(shū)看看，看過(guò)之后再看文獻(xiàn)，你自然就明白了。 你貼出的文獻(xiàn)里說(shuō)引物時(shí)特別提到“ corresponding to the amino acid sequence GKYTIG”，這是一個(gè)很關(guān)鍵的地方，你看過(guò)簡(jiǎn)并引物資料后應(yīng)該會(huì)明白，明白這個(gè)應(yīng)該就知道往后怎么做實(shí)驗(yàn)了。 最后祝你好運(yùn)��！還是要有點(diǎn)運(yùn)氣實(shí)驗(yàn)才能成功的。 |
4樓2015-01-08 20:12:42
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5樓2015-01-09 01:19:17
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有DNA序列的話就可以試試看用blastx來(lái)找到cDNA，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Bl ... LAST_INIT=blast2seq，找一些其他物種的hmgs蛋白和這個(gè)物種的hmgs基因比對(duì)，根據(jù)匹配情況可以推斷大致的開(kāi)放閱讀框。 |
6樓2015-01-09 08:43:18
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