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丫頭小盆子新蟲 (小有名氣)
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[求助]
Western 雜交不出條帶，求助 已有3人參與
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各位前輩及蟲友幫幫忙，最近做western雜交不出來目的條帶，想求助各位指教。具體情況如下： 因?yàn)槲易龅氖侵参锶~綠體蛋白，目的是想看葉綠體蛋白的變化情況，所以提取類囊體蛋白，用的是Hepes緩沖液。提取出的類囊體測(cè)定葉綠素含量后液氮速凍保存。跑western時(shí)，先跑了SDS膠用考馬斯亮藍(lán)定量，每孔上樣量以葉綠素含量來訂，大概是10ug每孔，最后以這個(gè)上樣量來做western雜交。其中轉(zhuǎn)膜為過夜，且maker也明顯轉(zhuǎn)到PVDF膜上了。再封閉2h，一抗5h，TBS清洗2次，每次20min，在用二抗雜交2h，最后再TBS清洗2次，每次10min。再顯色，其中一抗是PBS緩沖液配制的，二抗是TBS緩沖液配制的，最后顯色是采用堿性磷酸酶和NBT/BCIP一起來顯色的。但是做過兩次，第二次上樣量增加到15ug每孔的葉綠素，但是也都還是沒有目的條帶。其中考馬斯亮藍(lán)定量時(shí)，能看出目的條帶位置處是有條帶的。請(qǐng)問各位前輩知道是什么原因么？會(huì)不會(huì)是因?yàn)橐豢苟咕彌_液不同導(dǎo)致的呢？還是說是因?yàn)橐豢固禺愋圆桓撸ǖ且豢故莿傎I回來，按說明書稀釋保存的，-20°C保存大概半年）？請(qǐng)各位前輩幫幫忙，不勝感激！ |
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2樓2015-02-08 07:53:33
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3樓2015-02-08 12:41:38
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丫頭小盆子(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-02-08 20:28:52
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1.可以增加上樣量 2.一抗可以4°冰箱過夜，如果抗體效價(jià)不高可以增大一抗?jié)舛然蛘哐娱L(zhǎng)一抗孵育時(shí)間 3.洗一抗時(shí)，不要過于激烈，可以TBST洗5次，每次5min 4.二抗?jié)舛冗m當(dāng)，室溫孵育1h即可（確定二抗沒問題，可以做個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，或者實(shí)驗(yàn)室其他人用一下，看是否工作） 5.洗二抗同洗一抗 6.我一般是選擇ELC顯影，沒用過堿性磷酸酶顯色法，所以沒有有用的意見提供~~ 封閉是用封閉液將PVDF膜沒有結(jié)合蛋白的地方封閉上，減少背景，所以搖動(dòng)要緩慢，提供充足的接觸，也可以不要?jiǎng)�，或者封閉過夜都可以。洗膜時(shí)搖動(dòng)劇烈可能會(huì)將一抗洗掉，所以不要過于激烈。 祝實(shí)驗(yàn)順利~~ |
4樓2015-02-08 13:57:26
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