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[交流]
求助RACE交流經(jīng)驗(yàn) 已有3人參與
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| 各位大俠，我現(xiàn)在做3’和5‘race遇到了瓶頸，都說(shuō)3’比5'好做，而我是哪個(gè)都做不出來(lái)，我是用兼并引物千辛萬(wàn)苦調(diào)的中間序列，按照invitrogen公司RACE試劑盒中的接頭引物設(shè)計(jì)并合成的引物，分別是P1，P2，P3，P4 ，做3’race 用P1做逆轉(zhuǎn)錄，用P3和自己設(shè)計(jì)的一條上游特異性引物做 TouchDown PCR(普通PCR效果不如touchdown)，同時(shí)還設(shè)計(jì)了巢式引物，現(xiàn)在的結(jié)果是，PCR有條帶，測(cè)序結(jié)果顯示上下游引物正確且包含polyA尾，但是除了引物部分，剩下的序列就不是我想要的目的序列，我猜測(cè)是引物特異性差以及模板豐度低。5' 試過(guò)幾回，用的是3‘端加C的方法，沒(méi)有用試劑盒，都是自己買(mǎi)的酶，大部分是TAKARA的，PCR結(jié)果條帶雜，且沒(méi)有較為突出的亮帶，內(nèi)嵌結(jié)果也不理想，出現(xiàn)抹帶。 眼瞅著就要畢業(yè)了，還在做序列，請(qǐng)各位同仁做的好的經(jīng)驗(yàn)豐富的多多指教 |
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上莊王寧
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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你好，我現(xiàn)在也是要克隆一個(gè)未知基因，需要先設(shè)計(jì)兼并引物，克隆中間片段，再利用race擴(kuò)兩段，但是現(xiàn)在我就是想問(wèn)一下這個(gè)中間片段在基因中的位置有要求嗎？ 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
2樓2016-03-04 08:40:51
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4樓2016-09-07 09:54:03
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