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[交流]
求助RACE交流經(jīng)驗 已有3人參與
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| 各位大俠，我現(xiàn)在做3’和5‘race遇到了瓶頸，都說3’比5'好做，而我是哪個都做不出來，我是用兼并引物千辛萬苦調(diào)的中間序列，按照invitrogen公司RACE試劑盒中的接頭引物設(shè)計并合成的引物，分別是P1，P2，P3，P4 ，做3’race 用P1做逆轉(zhuǎn)錄，用P3和自己設(shè)計的一條上游特異性引物做 TouchDown PCR(普通PCR效果不如touchdown)，同時還設(shè)計了巢式引物，現(xiàn)在的結(jié)果是，PCR有條帶，測序結(jié)果顯示上下游引物正確且包含polyA尾，但是除了引物部分，剩下的序列就不是我想要的目的序列，我猜測是引物特異性差以及模板豐度低。5' 試過幾回，用的是3‘端加C的方法，沒有用試劑盒，都是自己買的酶，大部分是TAKARA的，PCR結(jié)果條帶雜，且沒有較為突出的亮帶，內(nèi)嵌結(jié)果也不理想，出現(xiàn)抹帶。 眼瞅著就要畢業(yè)了，還在做序列，請各位同仁做的好的經(jīng)驗豐富的多多指教 |
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jinnini125
木蟲 (小有名氣)
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4樓2016-09-07 09:54:03
上莊王寧
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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你好，我現(xiàn)在也是要克隆一個未知基因，需要先設(shè)計兼并引物，克隆中間片段，再利用race擴兩段，但是現(xiàn)在我就是想問一下這個中間片段在基因中的位置有要求嗎？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2016-03-04 08:40:51
3樓2016-09-04 09:58:05
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