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[求助]
PCR條帶彌散，不知道是什么原因，希望各位師兄師姐幫我看看。 已有4人參與
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各位師兄師姐，我最近一直在做PCR，想同源克隆大麥——小麥，從大麥中查找的序列，然后設計的引物，模板是小麥的cdna，一般情況下跑出來得條帶是彌散的。有條帶的大小也和預計的不一樣，預計大小在1300bp左右，看圖片上的條帶都超過2000bp了。 不知道哪里出現了問題，模板前些日子剛用tubling擴了一次，都是有條帶的。 第二個問題：為什么第二幅圖的條帶都是連續(xù)的兩條？我以前用小孔（10微升體系）的膠能擴出來一條1300bp的，但是換了大孔（20微升體系）的膠（為了回收）怎么就擴不出來了呢。 我用的酶是方塔高保真酶。 體系（10微升）：酶 0.2 引物1、引物2：各0.4 buffer： 5 dntp: 0.2 水 3.6 模板： 0.1 pcr反應條件：95——3min 95 ——15s 53——15s(有條帶的那張)、65——15s(以前一直沒有條帶彌散，所以一直升高退火溫度，可是還沒有。。。) 72——1min30s 72—— 5min 一共33循環(huán)。 麻煩各位老師，師兄師姐幫我看看。 1.jpg 1`.jpg |
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jurkat.1640
至尊木蟲 (文壇精英)
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3樓2015-03-24 12:03:40
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【答案】應助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應助指數 +1
西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2015-03-24 23:12:09
感謝參與，應助指數 +1
西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2015-03-24 23:12:09
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原因有很多啊 1 確定模板的純度（不純可能會有抑制PCR的東西），確定模板沒有降解 2 引物的特異性太差了，或者酶的特異性太差（一般建議1300bp不使用高保真聚合酶，一般的熱啟動Taq酶即可） 3 buffer的質量（或者說是PCR試劑盒的質量吧）及buffer里是否有鎂離子，可以適當對鎂離子濃度進行優(yōu)化，也可以加DMSO有助于擴增 4 你現在是沒有條帶擴增出來，應該降低退火溫度，當你擴增出有很多雜帶的情況下才應該升高退火溫度 5 也可適當的減少循環(huán)次數 6 還有跑膠時候的電壓問題，制膠的膠的質量 7 用水問題，水的pH值也會有影響，不能太酸 因為現在不知道問題在哪，所以在簡單的原因也要考慮其中啊 希望早日找到 問題所在  |
2樓2015-03-24 09:02:51
4樓2015-03-24 12:32:25
5樓2015-03-24 12:51:20
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