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隨機(jī)漫步lxw新蟲 (小有名氣)
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請(qǐng)教:腫瘤試驗(yàn)專家評(píng)價(jià)一下我的腫瘤試驗(yàn)方案
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試驗(yàn)的思路源自于: 有比較多的文獻(xiàn)驗(yàn)證了如下的理論: 1、提高ROS水平,可以促使癌細(xì)胞凋亡,從而抗癌(比如:Targeting Oxidative Stress in Embryonal Rhabdomyosarcoma,Antioxidants Accelerate Lung Cancer Progression in Mice,Selective killing of cancer cells with a small molecule targeting stress response to ROS等); 2、提高ROS,可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)(具體是抑制),從而可以治療自身免疫性疾病(比如:A New Arthritis Therapy with Oxidative Burst Inducers,Eriocalyxin B ameliorates experimental autoimmune ncephalomyelitis by suppressing Th1 and Th17 cells等),因?yàn)檠装Y和癌癥有直接關(guān)系,如果將炎癥消除,是不是部分對(duì)抗癌也是有益的?在這方面,有文獻(xiàn)指出二甲雙胍、布洛芬、阿司匹林等藥物既有抗炎作用也有抗癌作用。 3、ROS水平提升有助于組織再生(比如Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration, Sustained production of ROS triggers compensatory proliferation and is required for regeneration to proceed等 )。 結(jié)合以上三個(gè)思路,我們其實(shí)很容易的出,提高ROS有助于抗癌,而且可以做到標(biāo)本兼治,首先,ROS有助于促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡,這是目前絕大多數(shù)治療的目標(biāo);其次,ROS可以消除炎癥,調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),使癌細(xì)胞發(fā)生凋亡后,炎癥不能促進(jìn)新的癌細(xì)胞再生和轉(zhuǎn)移;第三,當(dāng)癌細(xì)胞和炎癥細(xì)胞消失后,組織留下的傷口需要愈合,再利用ROS的促進(jìn)再生作用達(dá)到傷口的快速愈合。因此只需補(bǔ)充或提供ROS就能夠達(dá)到全方位抗癌的作用。 但是,在體內(nèi)內(nèi)源性的提高ROS顯然不是一個(gè)簡(jiǎn)單的方法,比如節(jié)食、運(yùn)動(dòng)、雷帕霉素、二甲雙胍等內(nèi)源性提供ROS的產(chǎn)出,對(duì)于抗癌有一定作用,但是在臨床利用上是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足的。既然內(nèi)源性提高ROS是一個(gè)不可能完成的任務(wù),那么外源性的補(bǔ)充ROS呢?這樣是不是一個(gè)很棒的思路? ROS一般是過氧化氫,一氧化氮,超氧陰離子,除了一氧化氮前體,很少有文獻(xiàn)提到外源性補(bǔ)充這些物質(zhì),包括他們的前體,我想這些物質(zhì)的特性造成了外源性補(bǔ)充不可行。 如果外源性補(bǔ)充ROS不可行,換一個(gè)思路,外源性補(bǔ)充類ROS是否可行? 正好,我手里有幾個(gè)專利,其中用的的物質(zhì)就具有很好的ROS特性,比如氧化還原電位、溶于水的情況等等。我做了很多實(shí)驗(yàn),也驗(yàn)證了這種物質(zhì)可以消炎也可以促進(jìn)再生,在體外實(shí)驗(yàn)可以促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。我理所當(dāng)然的任務(wù)這個(gè)物質(zhì)可以抗癌,所以目前在進(jìn)一步做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。 幾乎所有的抗衰老、抗癌、抗炎癥的藥物都可以找到ROS的因子,然大部分人還是受到自由基有害的影響而不顧證據(jù)就認(rèn)為ROS是有害的。 具體的試驗(yàn)方案: 外源性補(bǔ)充類活性氧即二氧化氯溶液對(duì)腫瘤的影響研究 1 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 1.1 二氧化氯對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用 1.1.1 用MTT法檢測(cè)二氧化氯對(duì)腫瘤細(xì)胞(見下圖)和正常細(xì)胞(見下圖)活性的抑制作用。(二氧化氯濃度100ppm,1000ppm,2900ppm,高濃度(2%),pH值分1、4、6;高濃度添加DMSO(1:1)) 1.1.2 用AV/PI雙染法計(jì)算二氧化氯針對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡和壞死作用,研究二氧化氯對(duì)腫瘤細(xì)胞的具體殺滅作用。 1.1.3 利用Comet Assay分析二氧化氯對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA damage。 1.2 二氧化氯對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)理 1.2.1 用HPF、mitosox red 結(jié)合流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)二氧化氯處理后的腫瘤細(xì)胞ROS水平。 1.2.2 用H2DCF-DA探針觀察二氧化氯處理后的腫瘤細(xì)胞ROS水平,連續(xù)觀察繪制變化曲線。 1.2.3 用二氧化氯處理后,5分鐘內(nèi)再分別用維生素E和過氧化氫酶處理后,再分別觀察腫瘤細(xì)胞ROS水平,檢測(cè)使用抗氧化劑是否抑制二氧化氯依靠氧化作用殺滅腫瘤細(xì)胞。 1.2.4 利用BODIPY 581/591 C11觀察腫瘤細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。 2 二氧化氯對(duì)腫瘤作用的體內(nèi)試驗(yàn) 2.1 動(dòng)物模型建立:C57BL/6小鼠200只,分對(duì)照組、藥物高劑量組、藥物中劑量組、藥物低劑量組。 2.2 二氧化氯對(duì)動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的作用:瘤內(nèi)注射,7天一次,1-50天,對(duì)照組與二氧化氯濃度組(現(xiàn)配的高濃度添加DMSO(1:1))。 2.2.1 每日測(cè)量腫瘤大小、動(dòng)物體制、動(dòng)物死亡情況,繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線和動(dòng)物生存曲線。 2.2.2 選擇1h、24h和72h腫瘤組織,進(jìn)行HE染色,觀察腫瘤病理情況。 2.3 免疫組化檢測(cè)腫瘤組織。 2.3.1 Luminex技術(shù)(液相芯片檢測(cè)技術(shù))分別檢測(cè)(注射后3天)腫瘤組織(和對(duì)照組)PD-1,IFN-γ,TGF-β,IL-2,VEGF,IGF-1,IL-1β和TNF-α蛋白含量。 2.3.2 分別檢測(cè)對(duì)照組和試驗(yàn)組(注射后1天、3天和6天)腫瘤組織CD8+,CD4+,CD3+ TIL NKT 細(xì)胞數(shù)量。 2.3.3 在腫瘤接種后,每周一次用抗體mAbs消除CD4,CD8,NK細(xì)胞,觀察缺乏免疫細(xì)胞的情況下,二氧化氯對(duì)腫瘤組織的影響。 (目的:觀察用抗體消除CD8等T細(xì)胞前后,二氧化氯注射對(duì)于腫瘤的影響,來判斷二氧化氯是否具有ROS的功能如激活T細(xì)胞免疫來促進(jìn)腫瘤縮。 2.3.4 在建立腫瘤模型的過程第3、6和9天腹腔給抗體mAbs消除CTLA-4/PD-1,注射后的若干天(比如21天),測(cè)量腫瘤細(xì)胞的大小。 (目的:觀察缺乏與否腫瘤免疫T細(xì)胞負(fù)向調(diào)控通路CTLA-4/PD-1對(duì)二氧化氯對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的影響,來判斷二氧化氯是否具有ROS的功能如激活T細(xì)胞免疫來促進(jìn)腫瘤縮小,此外可以和CTLA-4/PD-1做一個(gè)對(duì)照) Sample Text 2.4 使用二氧化氯溶液注射正常組織,觀察情況。 2.5 使用靜脈注射,觀察情況。 |
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