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請教：腫瘤試驗專家評價一下我的腫瘤試驗方案
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試驗的思路源自于： 有比較多的文獻驗證了如下的理論： 1、提高ROS水平，可以促使癌細(xì)胞凋亡，從而抗癌（比如：Targeting Oxidative Stress in Embryonal Rhabdomyosarcoma，Antioxidants Accelerate Lung Cancer Progression in Mice，Selective killing of cancer cells with a small molecule targeting stress response to ROS等）； 2、提高ROS，可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)（具體是抑制），從而可以治療自身免疫性疾病（比如：A New Arthritis Therapy with Oxidative Burst Inducers，Eriocalyxin B ameliorates experimental autoimmune ncephalomyelitis by suppressing Th1 and Th17 cells等），因為炎癥和癌癥有直接關(guān)系，如果將炎癥消除，是不是部分對抗癌也是有益的？在這方面，有文獻指出二甲雙胍、布洛芬、阿司匹林等藥物既有抗炎作用也有抗癌作用。 3、ROS水平提升有助于組織再生（比如Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration， Sustained production of ROS triggers compensatory proliferation and is required for regeneration to proceed等 ）。 結(jié)合以上三個思路，我們其實很容易的出，提高ROS有助于抗癌，而且可以做到標(biāo)本兼治，首先，ROS有助于促進癌細(xì)胞凋亡，這是目前絕大多數(shù)治療的目標(biāo)；其次，ROS可以消除炎癥，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，使癌細(xì)胞發(fā)生凋亡后，炎癥不能促進新的癌細(xì)胞再生和轉(zhuǎn)移；第三，當(dāng)癌細(xì)胞和炎癥細(xì)胞消失后，組織留下的傷口需要愈合，再利用ROS的促進再生作用達(dá)到傷口的快速愈合。因此只需補充或提供ROS就能夠達(dá)到全方位抗癌的作用。 但是，在體內(nèi)內(nèi)源性的提高ROS顯然不是一個簡單的方法，比如節(jié)食、運動、雷帕霉素、二甲雙胍等內(nèi)源性提供ROS的產(chǎn)出，對于抗癌有一定作用，但是在臨床利用上是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足的。既然內(nèi)源性提高ROS是一個不可能完成的任務(wù)，那么外源性的補充ROS呢？這樣是不是一個很棒的思路？ ROS一般是過氧化氫，一氧化氮，超氧陰離子，除了一氧化氮前體，很少有文獻提到外源性補充這些物質(zhì)，包括他們的前體，我想這些物質(zhì)的特性造成了外源性補充不可行。 如果外源性補充ROS不可行，換一個思路，外源性補充類ROS是否可行？ 正好，我手里有幾個專利，其中用的的物質(zhì)就具有很好的ROS特性，比如氧化還原電位、溶于水的情況等等。我做了很多實驗，也驗證了這種物質(zhì)可以消炎也可以促進再生，在體外實驗可以促進癌細(xì)胞的凋亡。我理所當(dāng)然的任務(wù)這個物質(zhì)可以抗癌，所以目前在進一步做動物實驗。 幾乎所有的抗衰老、抗癌、抗炎癥的藥物都可以找到ROS的因子，然大部分人還是受到自由基有害的影響而不顧證據(jù)就認(rèn)為ROS是有害的。 具體的試驗方案： 外源性補充類活性氧即二氧化氯溶液對腫瘤的影響研究 1 體外細(xì)胞實驗 1.1 二氧化氯對腫瘤細(xì)胞的作用 1.1.1 用MTT法檢測二氧化氯對腫瘤細(xì)胞（見下圖）和正常細(xì)胞（見下圖）活性的抑制作用。（二氧化氯濃度100ppm，1000ppm，2900ppm，高濃度（2%），pH值分1、4、6；高濃度添加DMSO(1:1)） 1.1.2 用AV/PI雙染法計算二氧化氯針對腫瘤細(xì)胞的凋亡和壞死作用，研究二氧化氯對腫瘤細(xì)胞的具體殺滅作用。 1.1.3 利用Comet Assay分析二氧化氯對腫瘤細(xì)胞DNA damage。 1.2 二氧化氯對腫瘤細(xì)胞的作用機理 1.2.1 用HPF、mitosox red 結(jié)合流式細(xì)胞儀監(jiān)測二氧化氯處理后的腫瘤細(xì)胞ROS水平。 1.2.2 用H2DCF-DA探針觀察二氧化氯處理后的腫瘤細(xì)胞ROS水平，連續(xù)觀察繪制變化曲線。 1.2.3 用二氧化氯處理后，5分鐘內(nèi)再分別用維生素E和過氧化氫酶處理后，再分別觀察腫瘤細(xì)胞ROS水平，檢測使用抗氧化劑是否抑制二氧化氯依靠氧化作用殺滅腫瘤細(xì)胞。 1.2.4 利用BODIPY 581/591 C11觀察腫瘤細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。 2 二氧化氯對腫瘤作用的體內(nèi)試驗 2.1 動物模型建立：C57BL/6小鼠200只，分對照組、藥物高劑量組、藥物中劑量組、藥物低劑量組。 2.2 二氧化氯對動物體內(nèi)腫瘤的作用：瘤內(nèi)注射，7天一次，1-50天，對照組與二氧化氯濃度組（現(xiàn)配的高濃度添加DMSO(1:1)）。 2.2.1 每日測量腫瘤大小、動物體制、動物死亡情況，繪制腫瘤生長曲線和動物生存曲線。 2.2.2 選擇1h、24h和72h腫瘤組織，進行HE染色，觀察腫瘤病理情況。 2.3 免疫組化檢測腫瘤組織。 2.3.1 Luminex技術(shù)（液相芯片檢測技術(shù)）分別檢測（注射后3天）腫瘤組織（和對照組）PD-1，IFN-γ，TGF-β，IL-2，VEGF，IGF-1，IL-1β和TNF-α蛋白含量。 2.3.2 分別檢測對照組和試驗組（注射后1天、3天和6天）腫瘤組織CD8+,CD4+,CD3+ TIL NKT 細(xì)胞數(shù)量。 2.3.3 在腫瘤接種后，每周一次用抗體mAbs消除CD4,CD8,NK細(xì)胞，觀察缺乏免疫細(xì)胞的情況下，二氧化氯對腫瘤組織的影響。 （目的：觀察用抗體消除CD8等T細(xì)胞前后，二氧化氯注射對于腫瘤的影響，來判斷二氧化氯是否具有ROS的功能如激活T細(xì)胞免疫來促進腫瘤縮小） 2.3.4 在建立腫瘤模型的過程第3、6和9天腹腔給抗體mAbs消除CTLA-4/PD-1，注射后的若干天（比如21天），測量腫瘤細(xì)胞的大小。 （目的：觀察缺乏與否腫瘤免疫T細(xì)胞負(fù)向調(diào)控通路CTLA-4/PD-1對二氧化氯對腫瘤細(xì)胞作用的影響，來判斷二氧化氯是否具有ROS的功能如激活T細(xì)胞免疫來促進腫瘤縮小，此外可以和CTLA-4/PD-1做一個對照） Sample Text 2.4 使用二氧化氯溶液注射正常組織，觀察情況。 2.5 使用靜脈注射，觀察情況。 |
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