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kaqikun新蟲 (初入文壇)
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[求助]
求高人指點(diǎn)不對(duì)稱PCR得到的產(chǎn)物是否為單鏈 已有1人參與
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為了得到單鏈DNA，做了不對(duì)稱PCR，模板為雙鏈PCR產(chǎn)物，下游引物濃度為上游引物濃度的1/50。電泳條件為1%普通瓊脂糖凝膠，120V電壓，EB染色。從左到右依次為4500Marker、gDNA、雙鏈PCR產(chǎn)物、不對(duì)稱PCR產(chǎn)物、2000Marker。可是從條帶位置看不對(duì)稱PCR產(chǎn)物只比雙鏈PCR產(chǎn)物小一點(diǎn)兒，不像論壇里有人說的單鏈PCR比雙鏈PCR要小一半左右所出的位置。 請(qǐng)高人指點(diǎn)：我這個(gè)不對(duì)稱PCR得到的產(chǎn)物是單鏈DNA嗎？如果是的話，這個(gè)單鏈出的位置對(duì)嗎？ ![\"求高人指點(diǎn)不對(duì)稱PCR得到的產(chǎn)物是否為單鏈\"](\"https://muchongimg.xmcimg.com/data/bcs/2015/0325/bw134h3455949_1427236863_554.jpg#opennewwindow\") |
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kaqikun
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kaqikun: 金幣+5, ★★★很有幫助 2015-03-29 15:33:23
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| 不對(duì)稱PCR有兩種方法，第一種，在PCR擴(kuò)增時(shí)，先用等濃度的引物PCR擴(kuò)增，先得到雙鏈DNA，然后以這雙鏈DNA為模板，再以其中的一條引物進(jìn)行第二次PCR，制備單鏈DNA。第二種方法，用不等量的PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，，擴(kuò)增后產(chǎn)生大量的單鏈DNA。這對(duì)引物分別稱為非限制引物和限制引物，他們的比例一般為50-100:1.在PCR擴(kuò)增的最初10-15個(gè)循環(huán)中，產(chǎn)物大多為雙鏈DNA，但是當(dāng)限制性引物消耗完之后，非限制性引物就會(huì)產(chǎn)生大量的單鏈DNA。這就是不對(duì)稱PCR。不對(duì)稱PCR的關(guān)鍵就是控制限制性引物的絕對(duì)量，這需要經(jīng)過實(shí)驗(yàn)多次摸索優(yōu)化兩條引物的量而最終得到最佳的比例。你現(xiàn)在的方法一次成功是有情可原的，關(guān)鍵是要優(yōu)化兩條引物的量，你現(xiàn)在的這個(gè)產(chǎn)物應(yīng)該不是單鏈DNA，或者你直接按照第一種方法做。 |
4樓2015-03-25 08:48:28
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8樓2016-01-27 16:47:35
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