 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 3644 | 回復(fù): 23 | ||||
serhhrr鐵蟲 (初入文壇)
|
[求助]
大片段PCR擴(kuò)增求助 已有4人參與
|
|||
| 我需要做一個(gè)RTPCR,擴(kuò)增未知目的條帶，大小約為3000bp，循環(huán)體系如下：94℃ 30s，54-60℃ 30s ， 72℃ 3-4min。酶的話用過(guò)LA Taq，Taq酶都用過(guò)，也換人操作過(guò)，可一直P不出來(lái)，求助各位高手�。� |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有76人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- PCR片段量少求教
已經(jīng)有7人回復(fù)
- PCR大片段問(wèn)題
已經(jīng)有15人回復(fù)
- PCR擴(kuò)增曲線往下趴的厲害，求原因，謝謝
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 如何擴(kuò)增GC含量較高的片段
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 求長(zhǎng)片段（7.5 kb）PCR擴(kuò)增方法？
已經(jīng)有17人回復(fù)
- KOD和Taq酶的PCR產(chǎn)物為什么不一樣？請(qǐng)各位高手指點(diǎn)一下！
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 有人用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA Polymerase P長(zhǎng)片段
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 短片段PCR擴(kuò)增
已經(jīng)有7人回復(fù)
- PCR出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，求高手解答
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 5kb大片段PCR擴(kuò)增求助
已經(jīng)有18人回復(fù)
- PCR產(chǎn)物繼續(xù)擴(kuò)增原來(lái)的片段效果會(huì)更好嗎？
已經(jīng)有16人回復(fù)
- 大片段PCR(2.1K)擴(kuò)增求助
已經(jīng)有12人回復(fù)
- 3個(gè)片段的重疊pcr能否一步到位？
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 求助：PCR擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果引物中間多出150bp的片段
已經(jīng)有5人回復(fù)
- PCR時(shí)出現(xiàn)了非目的片段的超大片段條帶
已經(jīng)有16人回復(fù)
- 反轉(zhuǎn)錄之后PCR擴(kuò)增片段問(wèn)題的請(qǐng)教，急急急
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 求助：誰(shuí)有2008-2011年中國(guó)農(nóng)業(yè)年鑒？
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 大片段PCR擴(kuò)增求助
已經(jīng)有34人回復(fù)
- 求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 高GC含量基因片段PCR問(wèn)題
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 真菌ITS序列PCR擴(kuò)增 求助
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 關(guān)于CDNA的擴(kuò)增問(wèn)題
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 【求助/交流】菌落PCR擴(kuò)出來(lái)的片段不是目的片段，咋辦啊？？？？
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 【求助/交流】以cDNA為模板PCR擴(kuò)增目的片段時(shí)條帶較淺原因
已經(jīng)有13人回復(fù)
一葦杭之xmc
銀蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 995.2
- 帖子: 42
- 在線: 45.5小時(shí)
- 蟲號(hào): 1804835
- 注冊(cè): 2012-05-09
- 性別: MM
- 專業(yè): 環(huán)境工程
5樓2013-10-23 17:27:47
凌波麗
專家顧問(wèn) (知名作家)
-
專家經(jīng)驗(yàn): +218 - MolEPI: 44
- 應(yīng)助: 397 (碩士)
- 貴賓: 0.044
- 金幣: 2118.9
- 散金: 10
- 紅花: 208
- 帖子: 5633
- 在線: 571.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 1766465
- 注冊(cè): 2012-04-19
- 性別: MM
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
- 管轄: 生物科學(xué)綜合
【答案】應(yīng)助回帖
|
樓主的情況是長(zhǎng)片段PCR不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。我剛剛根據(jù)樓主的情況寫了一份參考資料，樓主可以參考。與所有的我過(guò)去回答過(guò)的常規(guī)PCR的問(wèn)題與解答都不同。 長(zhǎng)片段PCR不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的原因和對(duì)策 2013-11-10 PCR反應(yīng)的主要的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有:1.模板DNA的質(zhì)量，2.模板DNA的長(zhǎng)度過(guò)大，2.需要增加DNA聚合酶的專一性，3.緩沖溶液變質(zhì)需要更換，3.引物的質(zhì)量，4. 緩沖溶液，5. 引物，5.Mg2+ 濃度，6. Mg2+ 濃度，6.反應(yīng)體積的改變，7. 反應(yīng)體積的改變，8.物理原因，9.靶序列變異，10. 靶序列變異：11.長(zhǎng)片段的變性、退火和延伸與常規(guī)PCR有所不同，一般要長(zhǎng)一些，尤其是DNA聚合酶對(duì)于DNA單鏈的延伸時(shí)間。長(zhǎng)片段PCR和普通PCR在不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的情況基本上是一樣的。這里根據(jù)長(zhǎng)片段PCR的情況寫的，有些地方不適用于常規(guī)PCR。 樓主的情況是長(zhǎng)片段PCR不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，原因與解決方法如下： 下面是尋找原因并且針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析原因與相應(yīng)的對(duì)策，最后寫出了調(diào)整順序�！� 一、原因及相應(yīng)的對(duì)策： 1. DNA模板不純，混入了雜質(zhì)：(1)模板中含有雜蛋白質(zhì)。(2)模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，此時(shí)A260/A280>1.8。(3)DNA模板溶液吸入了酚或者SDS。對(duì)策：重新提取DNA模板，去除蛋白質(zhì)（比如：用Tris-HCl+飽和酚抽提DNA，DNA融于水相，同時(shí)變性沉淀蛋白質(zhì)位于水相與苯酚相之間，可用吸管吸走變性沉淀蛋白質(zhì)層，接著棄去苯酚相，最后用乙醇沉淀DNA）和小分子（透析、超濾等）。長(zhǎng)片段PCR的模板用量一般是100pg-2ug。而且長(zhǎng)片段PCR的DNA模板的純度要求一般比常規(guī)的PCR要更一些，所以反應(yīng)前應(yīng)該充分提純。 2. DNA模板發(fā)生了降解：反復(fù)凍融或者長(zhǎng)期在冰箱的冷藏箱里，導(dǎo)致降解。使用凝膠電泳檢驗(yàn)DNA模板是否存在降解，即有有明顯彌散帶出現(xiàn)。如果DNA模板存在降解則用為降解的DNA模板，或者重新提取DNA模板。 3. 需要增加DNA聚合酶的專一性。 現(xiàn)在已經(jīng)有多種商用的長(zhǎng)片段PCR的DNA聚合酶可以選擇使用。首先選擇質(zhì)量好的商用的長(zhǎng)片段PCR的DNA聚合酶。商用的長(zhǎng)片段PCR的DNA聚合酶的添加劑不同于常規(guī)的PCR，一般不添加BSA，而加入30-100mmol/L的二甲基亞砜，100-150mmol/L的甘油，50-150g/L的PEG6000, 50-150mmol/L的甲酰胺，約5ug/L的大腸桿菌DNA單鏈結(jié)合蛋白，10-100mmol/L的氯化四乙銨，約0.1g/L的明膠等，每次加一種，別都加進(jìn)去。也可以根據(jù)試劑盒的商業(yè)說(shuō)明操作加入添加劑。注意加入時(shí)分梯度進(jìn)行。 4. 緩沖溶液：最好都是新配置的，類別濃度要正確別加錯(cuò)了，這步可能是太基本很不被注意。 5. 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：(1)選定一個(gè)好的引物合成單位。(2)引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，需要調(diào)整引物的濃度，在反應(yīng)時(shí)加入濃度基本相同的引物。(3)引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。(4)引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。（5）在引物的Tm范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性問(wèn)題可以大大減少引物與模板的非特異性的結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。（6）引物3’末端用GC可以增加PCR的專一性擴(kuò)增�！� 6. Mg2+ 濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。Mg2+ 濃度一般可能與的dNTP濃度存在同方向偶聯(lián)效應(yīng)。如果是長(zhǎng)片段PCR，更不同的產(chǎn)品試劑盒對(duì)于Mg2+ 濃度進(jìn)行調(diào)整。 在長(zhǎng)片段PCR中Mg2+ 濃度一般比常規(guī)的Mg2+ 濃度高，一般是2-6mmol/L，可以分梯度調(diào)整。也有高達(dá)10mmol/L和低至1mmol/L的，可以根據(jù)試劑盒的商家說(shuō)明加以梯度調(diào)整�！ � 7. 反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20μL、30μL、50μL或100μL，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20μL 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。具體反應(yīng)體積根據(jù)長(zhǎng)片段PCR試劑盒的說(shuō)明確定。 8. 物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。沒有重新設(shè)計(jì)引物，不要大范圍地變動(dòng)反應(yīng)體系的復(fù)性溫度，要在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)變動(dòng)�！ � 9. 靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。這需要重新設(shè)計(jì)引物。 10.長(zhǎng)片段PCR適宜使用熱啟動(dòng)或者降落PCR。 11.長(zhǎng)片段的變性、退火和延伸與常規(guī)PCR有所不同，一般要長(zhǎng)一些，尤其是DNA聚合酶對(duì)于DNA單鏈的延伸時(shí)間。DNA聚合酶的延伸時(shí)間大致根據(jù)每分鐘1000bp的聚合酶的速率來(lái)計(jì)算后確定，要保證每次延伸時(shí)間都?jí)駾NA聚合酶完全聚合完畢DNA單鏈。 一般三階段熱循環(huán)法的溫度和時(shí)間為：92-97度需時(shí)間15 s-1min,60-67度 需時(shí)間約1min，68-69度需時(shí)間約5-20 min。共循環(huán)25-30次。 首次變性溫度和時(shí)間為：93-94度，2min，終末延伸溫度和時(shí)間：68-69度，需時(shí)間約7 min. 具體參數(shù)根據(jù)具體的長(zhǎng)片段PCR試劑盒的要求而作具體調(diào)整。 |
16樓2013-11-11 00:05:20
2樓2013-10-23 16:04:49
serhhrr
鐵蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 195.5
- 帖子: 21
- 在線: 26.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 1461407
- 注冊(cè): 2011-10-26
- 性別: GG
- 專業(yè): 微生物資源與分類學(xué)
3樓2013-10-23 16:52:20
taccycle
銅蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 14 (小學(xué)生)
- 金幣: 112.9
- 帖子: 60
- 在線: 19.5小時(shí)
- 蟲號(hào): 2364578
- 注冊(cè): 2013-03-21
- 性別: GG
- 專業(yè): 遺傳學(xué)研究新技術(shù)與方法
4樓2013-10-23 17:17:02
|
http://www.baidupcs.com/file/170 ... ;to=wb&fm=B,B,T,t&expires=8h&rt=pr&r=434070297&logid=3557013314&fn=A%20new%20protocol%20for%20highly%20efficient.pdf 這里有篇文章講長(zhǎng)鏈擴(kuò)增的，用到兩種酶混用。不知道對(duì)你有沒有幫助。 |
6樓2013-10-23 18:12:28
happy361
木蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 8 (幼兒園)
- 金幣: 2976.9
- 紅花: 2
- 帖子: 381
- 在線: 159.2小時(shí)
- 蟲號(hào): 396076
- 注冊(cè): 2007-06-08
- 專業(yè): 微生物遺傳育種學(xué)
7樓2013-10-24 08:46:31
lgd19891003
鐵蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 487
- 帖子: 16
- 在線: 11.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 2748692
- 注冊(cè): 2013-10-23
- 性別: GG
- 專業(yè): 微生物資源與分類學(xué)
8樓2013-10-24 23:25:12
穆憶楓
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 1.1
- 帖子: 14
- 在線: 2.3小時(shí)
- 蟲號(hào): 2751595
- 注冊(cè): 2013-10-24
- 專業(yè): 免疫生物學(xué)
9樓2013-10-24 23:47:41
laojiu9878
至尊木蟲 (知名作家)
九牛
- 應(yīng)助: 60 (初中生)
- 金幣: 30267.8
- 紅花: 3
- 帖子: 9694
- 在線: 230.5小時(shí)
- 蟲號(hào): 617287
- 注冊(cè): 2008-10-05
- 性別: GG
- 專業(yè): 微生物生理與生物化學(xué)
10樓2013-10-25 09:03:43
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 serhhrr 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 281求調(diào)劑（0805） +3 | 煙汐憶海 2026-03-16 | 8/400 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[基金申請(qǐng)] 被我言中：新模板不強(qiáng)調(diào)格式了，假專家開始管格式了 +4 | beefly 2026-03-14 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 326求調(diào)劑 +5 | 上岸的小葡 2026-03-15 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 274求調(diào)劑0856材料化工 +13 | z2839474511 2026-03-11 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 梁成偉老師課題組歡迎你的加入 +8 | 一鴨鴨喲 2026-03-14 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 285化工學(xué)碩求調(diào)劑（081700） +9 | 柴郡貓_ 2026-03-12 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 材料專碩274一志愿陜西師范大學(xué)求調(diào)劑 +5 | 薛云鵬 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 267一志愿南京工業(yè)大學(xué)0817化工求調(diào)劑 +6 | SUICHILD 2026-03-12 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 283求調(diào)劑 +3 | 聽風(fēng)就是雨； 2026-03-16 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 +6 | 妮妮ninicgb 2026-03-15 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 311求調(diào)劑 +5 | 26研0 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 080500，材料學(xué)碩302分求調(diào)劑學(xué)校 +4 | 初識(shí)可樂(lè) 2026-03-14 | 5/250 |
|
|
|
[基金申請(qǐng)]
有必要更換申報(bào)口嗎
 20+3
|
fannyamoy 2026-03-11 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)一志愿211 總分320求調(diào)劑 +5 | 瑪卡巴卡啊哈 2026-03-11 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 329求調(diào)劑 +3 | miaodesi 2026-03-12 | 4/200 |
|
|
|
[碩博家園] 085600 260分求調(diào)劑 +3 | 天空還下雨么 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)求調(diào)劑 +7 | 綠豆芹菜湯 2026-03-12 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 材料301分求調(diào)劑 +5 | Liyouyumairs 2026-03-12 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0817化學(xué)工程與技術(shù)考研312分調(diào)劑 +3 | T123 tt 2026-03-12 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 321求調(diào)劑（食品/專碩） +3 | xc321 2026-03-12 | 6/300 |
|