版塊導(dǎo)航: 正在加載中...

應(yīng)《網(wǎng)絡(luò)安全法》要求，自2017年10月1日起，未進(jìn)行實(shí)名認(rèn)證將不得使用互聯(lián)網(wǎng)跟帖服務(wù)。為保障您的帳號(hào)能夠正常使用，請(qǐng)盡快對(duì)帳號(hào)進(jìn)行手機(jī)號(hào)驗(yàn)證，感謝您的理解與支持！

24小時(shí)熱門(mén)版塊排行榜

返回列表

上一頁(yè)

下一頁(yè)

2008101111

金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)

學(xué)術(shù)江湖混子

應(yīng)助: 38 (小學(xué)生)
金幣: 1015.6
帖子: 385
在線: 100.5小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 604092
注冊(cè): 2008-09-16
性別: GG
專(zhuān)業(yè): 食品科學(xué)基礎(chǔ)

【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

LA酶就可以，7000bp的都弄出來(lái)了

贊一下

回復(fù)此樓

自主創(chuàng)業(yè)者，搗騰生物試劑

11樓2013-10-25 17:21:57

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

huanancy2012

銀蟲(chóng) (小有名氣)

應(yīng)助: 4 (幼兒園)
金幣: 1152.9
散金: 1
帖子: 168
在線: 61.4小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 2003497
注冊(cè): 2012-09-15
性別: GG
專(zhuān)業(yè): 生物化學(xué)

【答案】應(yīng)助回帖

★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流！ 2013-11-11 00:05:12

分段擴(kuò)增，再拼接�；蛘叻侄螖U(kuò)增后，作套式PCR。

贊一下

回復(fù)此樓

淡定人生！

12樓2013-10-26 15:26:37

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

趙永騰

木蟲(chóng) (小有名氣)

應(yīng)助: 17 (小學(xué)生)
金幣: 881.5
散金: 1005
紅花: 3
帖子: 132
在線: 101.9小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 1092908
注冊(cè): 2010-09-08
專(zhuān)業(yè): 微生物資源與分類(lèi)學(xué)

【答案】應(yīng)助回帖

退火溫度提高3度試試延伸時(shí)間也要提高

贊一下

回復(fù)此樓

13樓2013-11-10 10:21:52

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

jurkat.1640

至尊木蟲(chóng) (文壇精英)

MolEPI: 1
應(yīng)助: 908 (博后)
金幣: 17148.7
散金: 1654
紅花: 121
沙發(fā): 41
帖子: 14518
在線: 2183.8小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 514340
注冊(cè): 2008-02-28
性別: GG
專(zhuān)業(yè): 病毒學(xué)

【答案】應(yīng)助回帖

★ ★
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流！ 2013-11-11 00:05:19

估計(jì)不是酶和反應(yīng)時(shí)間的問(wèn)題，如果不要求高保真的話普通Taq酶應(yīng)該可以擴(kuò)增出3 kb片段。如果擴(kuò)增片段GC含量高可以用GC buffer。既然擴(kuò)增未知片段，不知道你的引物是什么樣的？

贊一下

回復(fù)此樓

14樓2013-11-10 11:03:43

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

Lovebirdshs

木蟲(chóng) (小有名氣)

應(yīng)助: 14 (小學(xué)生)
金幣: 1591.6
散金: 20
紅花: 3
帖子: 194
在線: 18.4小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 2770182
注冊(cè): 2013-11-01
專(zhuān)業(yè): 病原微生物與感染研究與診

【答案】應(yīng)助回帖

★ ★
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流！ 2013-11-11 00:05:26

才3000bp根本就不長(zhǎng)，RT-PCR能否成功第一輪至關(guān)重要，TAKARA LA-Taq是個(gè)不錯(cuò)的選擇，當(dāng)然前提是你的引物沒(méi)有問(wèn)題

贊一下

回復(fù)此樓

孤獨(dú)的舞者

15樓2013-11-10 20:20:14

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

凌波麗

專(zhuān)家顧問(wèn) (知名作家)

專(zhuān)家經(jīng)驗(yàn): +218
MolEPI: 44
應(yīng)助: 397 (碩士)
貴賓: 0.044
金幣: 2118.9
散金: 10
紅花: 208
帖子: 5633
在線: 571.6小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 1766465
注冊(cè): 2012-04-19
性別: MM
專(zhuān)業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
管轄: 生物科學(xué)綜合

【答案】應(yīng)助回帖

樓主的情況是長(zhǎng)片段PCR不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。我剛剛根據(jù)樓主的情況寫(xiě)了一份參考資料，樓主可以參考。與所有的我過(guò)去回答過(guò)的常規(guī)PCR的問(wèn)題與解答都不同。

長(zhǎng)片段PCR不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的原因和對(duì)策

2013-11-10

　　PCR反應(yīng)的主要的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有:1.模板DNA的質(zhì)量，2.模板DNA的長(zhǎng)度過(guò)大，2.需要增加DNA聚合酶的專(zhuān)一性，3.緩沖溶液變質(zhì)需要更換，3.引物的質(zhì)量，4. 緩沖溶液，5. 引物，5.Mg2+ 濃度，6. Mg2+ 濃度，6.反應(yīng)體積的改變，7. 反應(yīng)體積的改變，8.物理原因，9.靶序列變異，10. 靶序列變異：11.長(zhǎng)片段的變性、退火和延伸與常規(guī)PCR有所不同，一般要長(zhǎng)一些，尤其是DNA聚合酶對(duì)于DNA單鏈的延伸時(shí)間。長(zhǎng)片段PCR和普通PCR在不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的情況基本上是一樣的。這里根據(jù)長(zhǎng)片段PCR的情況寫(xiě)的，有些地方不適用于常規(guī)PCR。
　　
樓主的情況是長(zhǎng)片段PCR不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，原因與解決方法如下：　　

下面是尋找原因并且針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析原因與相應(yīng)的對(duì)策，最后寫(xiě)出了調(diào)整順序�！�
　
一、原因及相應(yīng)的對(duì)策：
1. DNA模板不純，混入了雜質(zhì)：(1)模板中含有雜蛋白質(zhì)。(2)模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，此時(shí)A260/A280>1.8。(3)DNA模板溶液吸入了酚或者SDS。對(duì)策：重新提取DNA模板，去除蛋白質(zhì)（比如：用Tris-HCl+飽和酚抽提DNA，DNA融于水相，同時(shí)變性沉淀蛋白質(zhì)位于水相與苯酚相之間，可用吸管吸走變性沉淀蛋白質(zhì)層，接著棄去苯酚相，最后用乙醇沉淀DNA）和小分子（透析、超濾等）。長(zhǎng)片段PCR的模板用量一般是100pg-2ug。而且長(zhǎng)片段PCR的DNA模板的純度要求一般比常規(guī)的PCR要更一些，所以反應(yīng)前應(yīng)該充分提純。

2. DNA模板發(fā)生了降解：反復(fù)凍融或者長(zhǎng)期在冰箱的冷藏箱里，導(dǎo)致降解。使用凝膠電泳檢驗(yàn)DNA模板是否存在降解，即有有明顯彌散帶出現(xiàn)。如果DNA模板存在降解則用為降解的DNA模板，或者重新提取DNA模板。

3. 需要增加DNA聚合酶的專(zhuān)一性。
現(xiàn)在已經(jīng)有多種商用的長(zhǎng)片段PCR的DNA聚合酶可以選擇使用。首先選擇質(zhì)量好的商用的長(zhǎng)片段PCR的DNA聚合酶。商用的長(zhǎng)片段PCR的DNA聚合酶的添加劑不同于常規(guī)的PCR，一般不添加BSA，而加入30-100mmol/L的二甲基亞砜，100-150mmol/L的甘油，50-150g/L的PEG6000, 50-150mmol/L的甲酰胺，約5ug/L的大腸桿菌DNA單鏈結(jié)合蛋白，10-100mmol/L的氯化四乙銨，約0.1g/L的明膠等，每次加一種，別都加進(jìn)去。也可以根據(jù)試劑盒的商業(yè)說(shuō)明操作加入添加劑。注意加入時(shí)分梯度進(jìn)行。
　　　
4. 緩沖溶液：最好都是新配置的，類(lèi)別濃度要正確別加錯(cuò)了，這步可能是太基本很不被注意。
　
5. 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱(chēng)，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增，對(duì)策為：(1)選定一個(gè)好的引物合成單位。(2)引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，需要調(diào)整引物的濃度，在反應(yīng)時(shí)加入濃度基本相同的引物。(3)引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。(4)引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。（5）在引物的Tm范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性問(wèn)題可以大大減少引物與模板的非特異性的結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。（6）引物3’末端用GC可以增加PCR的專(zhuān)一性擴(kuò)增�！�
　　　
6. Mg2+ 濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。Mg2+ 濃度一般可能與的dNTP濃度存在同方向偶聯(lián)效應(yīng)。如果是長(zhǎng)片段PCR，更不同的產(chǎn)品試劑盒對(duì)于Mg2+ 濃度進(jìn)行調(diào)整。
　　在長(zhǎng)片段PCR中Mg2+ 濃度一般比常規(guī)的Mg2+ 濃度高，一般是2-6mmol/L，可以分梯度調(diào)整。也有高達(dá)10mmol/L和低至1mmol/L的，可以根據(jù)試劑盒的商家說(shuō)明加以梯度調(diào)整�！　�

7. 反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20μL、30μL、50μL或100μL，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20μL 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。具體反應(yīng)體積根據(jù)長(zhǎng)片段PCR試劑盒的說(shuō)明確定。
　　　　
8. 物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。沒(méi)有重新設(shè)計(jì)引物，不要大范圍地變動(dòng)反應(yīng)體系的復(fù)性溫度，要在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)變動(dòng)�！　�
　　
9. 靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。這需要重新設(shè)計(jì)引物。

10.長(zhǎng)片段PCR適宜使用熱啟動(dòng)或者降落PCR。

11.長(zhǎng)片段的變性、退火和延伸與常規(guī)PCR有所不同，一般要長(zhǎng)一些，尤其是DNA聚合酶對(duì)于DNA單鏈的延伸時(shí)間。DNA聚合酶的延伸時(shí)間大致根據(jù)每分鐘1000bp的聚合酶的速率來(lái)計(jì)算后確定，要保證每次延伸時(shí)間都?jí)駾NA聚合酶完全聚合完畢DNA單鏈。
一般三階段熱循環(huán)法的溫度和時(shí)間為：92-97度需時(shí)間15 s-1min,60-67度需時(shí)間約1min，68-69度需時(shí)間約5-20 min。共循環(huán)25-30次。
首次變性溫度和時(shí)間為：93-94度，2min，終末延伸溫度和時(shí)間：68-69度，需時(shí)間約7 min.
具體參數(shù)根據(jù)具體的長(zhǎng)片段PCR試劑盒的要求而作具體調(diào)整。

贊一下(1人)

回復(fù)此樓

16樓2013-11-11 00:05:20

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

zh10246

鐵桿木蟲(chóng) (文壇精英)

應(yīng)助: 348 (大學(xué)生)
金幣: 13497
散金: 115
紅花: 47
帖子: 14588
在線: 878.6小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 2786456
注冊(cè): 2013-11-08
專(zhuān)業(yè): 細(xì)胞外基質(zhì)

【答案】應(yīng)助回帖

phusion酶不錯(cuò),我也建議試試，引物沒(méi)問(wèn)題吧

贊一下

回復(fù)此樓

17樓2013-11-15 19:39:28

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

zcsy

新蟲(chóng) (初入文壇)

應(yīng)助: 0 (幼兒園)
金幣: 29
帖子: 7
在線: 1.8小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 2443493
注冊(cè): 2013-05-01
性別: GG
專(zhuān)業(yè): 臨床獸醫(yī)學(xué)

【答案】應(yīng)助回帖

★ ★
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-01-29 17:20:21

我以前試過(guò)2000bp 的擴(kuò)增，有以下建議，希望對(duì)你有用：1、變性時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)，有助于模板雙鏈的打開(kāi)。2、模板鏈的GC含量太高的話不易合成長(zhǎng)鏈。不知道你的模板GC含量如何。建議用長(zhǎng)鏈擴(kuò)增的高保真酶。也可以試試MIX，MIX各組分比例比較適合，有助于PCR反應(yīng)。3、退火時(shí)間太短4、將3000bp分段P，相互之間有交叉，這樣可以后期測(cè)序拼接。

贊一下

回復(fù)此樓

加油！

18樓2014-01-02 19:39:50

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

凌波麗

專(zhuān)家顧問(wèn) (知名作家)

專(zhuān)家經(jīng)驗(yàn): +218
MolEPI: 44
應(yīng)助: 397 (碩士)
貴賓: 0.044
金幣: 2118.9
散金: 10
紅花: 208
帖子: 5633
在線: 571.6小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 1766465
注冊(cè): 2012-04-19
性別: MM
專(zhuān)業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
管轄: 生物科學(xué)綜合

【答案】應(yīng)助回帖

長(zhǎng)片段PC不同于一般PCR的特殊要求：
1.用Taq-LA DNA聚合酶，該酶是Taq酶或Klentaq 1（無(wú)糾錯(cuò)功能）與pfu酶或Deep Vent酶（有糾錯(cuò)功能）的混合物，以Taq酶為主。
2.當(dāng)需要擴(kuò)增的片段大于20kd時(shí)，需要加入高濃度的甜茶堿（終濃度為1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶堿加入后，要將擴(kuò)增反應(yīng)的溫度降低2-3度。樓主的擴(kuò)增片段還到不了2020kd,甜茶堿可以少加點(diǎn)。
3.適當(dāng)升高鎂離子濃度，不要太高了鎂離子濃度高于底物dNTP濃度即可。
4.變性時(shí)間要短，尤其是一般不超過(guò)30 s，尤其是模板長(zhǎng)度超過(guò)8KD時(shí)更是如此，變性時(shí)間長(zhǎng)會(huì)破壞模板。
5.延伸溫度可以下降為68攝氏度，同時(shí)加長(zhǎng)延伸反應(yīng)時(shí)間，長(zhǎng)度為3-5kd的模板延伸反應(yīng)時(shí)間為5-10分鐘，長(zhǎng)度為20-35kd的模板延伸反應(yīng)時(shí)間為20分鐘，樓主的PCR的延伸反應(yīng)時(shí)間可能為12-16分鐘左右。
6.模板濃度最好在1ng/L以內(nèi)。
7.應(yīng)用長(zhǎng)片段PCR緩沖溶液。10X長(zhǎng)片段PCR緩沖溶液組成為：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸銨，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。
8.設(shè)計(jì)較長(zhǎng)的PCR引物（25-30 bp)。

我今天的回答比過(guò)去的同類(lèi)問(wèn)題的回答要簡(jiǎn)便，應(yīng)該更容易操作一些。

贊一下

回復(fù)此樓

19樓2014-07-08 01:58:07

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

Neo2000

木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)

應(yīng)助: 639 (博士)
金幣: 8720.2
紅花: 37
帖子: 1700
在線: 269.3小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 322365
注冊(cè): 2007-03-11
專(zhuān)業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子

【答案】應(yīng)助回帖

很可能與引物不好有關(guān)，著重檢查這一塊有沒(méi)有問(wèn)題。

[ 發(fā)自小木蟲(chóng)客戶端 ]

贊一下

回復(fù)此樓

20樓2014-07-08 12:35:16

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn) 我要訂閱樓主 serhhrr 的主題更新

返回列表

上一頁(yè)

下一頁(yè)

普通表情龍兔虎貓

最具人氣熱帖推薦 [查看全部]		作者	回/看	最后發(fā)表

[考博] 環(huán)境領(lǐng)域全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室招收博士1-2名 +3	QGZDSYS 2026-03-13	3/150	2026-03-18 00:13 by PY-Hzb
[考研] 301求調(diào)劑 +6	yy要上岸呀 2026-03-17	6/300	2026-03-17 23:58 by 星空星月
[考研] 296求調(diào)劑 +5	大口吃飯身體健 2026-03-13	5/250	2026-03-17 21:05 by 不惑可樂(lè)
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑，六級(jí)已過(guò)，有科研經(jīng)歷 +8	曦熙兮 2026-03-15	8/400	2026-03-17 20:31 by xilongliang
[考研] 312求調(diào)劑 +4	陌宸希 2026-03-16	5/250	2026-03-17 17:09 by ruiyingmiao
[考研] 【0856】化學(xué)工程（085602）313 分，本科學(xué)科評(píng)估A類(lèi)院�；瘜W(xué)工程與工藝，誠(chéng)求調(diào)劑 +7	小劉快快上岸 2026-03-11	8/400	2026-03-17 16:57 by ruiyingmiao
[考研] 290求調(diào)劑 +3	p asserby. 2026-03-15	4/200	2026-03-17 16:35 by wangkm
[考研] 275求調(diào)劑 +4	太陽(yáng)花天天開(kāi)心 2026-03-16	4/200	2026-03-17 10:53 by 功夫瘋狂
[考研] 材料專(zhuān)碩274一志愿陜西師范大學(xué)求調(diào)劑 +5	薛云鵬 2026-03-13	5/250	2026-03-17 10:15 by Sammy2
[考研] 藥學(xué)383 求調(diào)劑 +3	藥學(xué)chy 2026-03-15	4/200	2026-03-16 20:51 by 元子^0^
[考研] 311求調(diào)劑 +5	26研0 2026-03-15	5/250	2026-03-16 16:21 by a不易
[考研] 070305求調(diào)劑 +3	mlpqaz03 2026-03-14	4/200	2026-03-15 11:04 by peike
[考研] 中科大材料與化工319求調(diào)劑 +3	孟鑫材料 2026-03-14	3/150	2026-03-14 20:10 by ms629
[考研] 復(fù)試調(diào)劑 +3	呼呼？~+123456 2026-03-14	3/150	2026-03-14 16:53 by WTUChen
[考研] 297求調(diào)劑 +4	學(xué)海漂泊 2026-03-13	4/200	2026-03-14 11:51 by 熱情沙漠
[考研] 330求調(diào)劑 +3	?醬給調(diào)劑跪了 2026-03-13	3/150	2026-03-14 10:13 by JourneyLucky
[考研] 四川大學(xué)085601材料工程專(zhuān)碩初試294求調(diào)劑 +4	祝我們好在冬天 2026-03-11	4/200	2026-03-13 21:39 by peike
[考研] 工科278分求調(diào)劑 +5	周慢熱啊 2026-03-12	7/350	2026-03-13 15:49 by JourneyLucky
[論文投稿] 投稿問(wèn)題 5+4	星光燦爛xt 2026-03-12	6/300	2026-03-13 14:17 by god_tian
[考研] 290求調(diào)劑 +3	ADT 2026-03-13	3/150	2026-03-13 10:19 by peike