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serhhrr鐵蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
大片段PCR擴(kuò)增求助 已有4人參與
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| 我需要做一個(gè)RTPCR,擴(kuò)增未知目的條帶，大小約為3000bp，循環(huán)體系如下：94℃ 30s，54-60℃ 30s ， 72℃ 3-4min。酶的話用過(guò)LA Taq，Taq酶都用過(guò)，也換人操作過(guò)，可一直P(pán)不出來(lái)，求助各位高手�。� |
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凌波麗
專家顧問(wèn) (知名作家)
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專家經(jīng)驗(yàn): +218 - MolEPI: 44
- 應(yīng)助: 397 (碩士)
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- 性別: MM
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
- 管轄: 生物科學(xué)綜合
【答案】應(yīng)助回帖
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樓主的情況是長(zhǎng)片段PCR不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。我剛剛根據(jù)樓主的情況寫(xiě)了一份參考資料，樓主可以參考。與所有的我過(guò)去回答過(guò)的常規(guī)PCR的問(wèn)題與解答都不同。 長(zhǎng)片段PCR不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的原因和對(duì)策 2013-11-10 PCR反應(yīng)的主要的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有:1.模板DNA的質(zhì)量，2.模板DNA的長(zhǎng)度過(guò)大，2.需要增加DNA聚合酶的專一性，3.緩沖溶液變質(zhì)需要更換，3.引物的質(zhì)量，4. 緩沖溶液，5. 引物，5.Mg2+ 濃度，6. Mg2+ 濃度，6.反應(yīng)體積的改變，7. 反應(yīng)體積的改變，8.物理原因，9.靶序列變異，10. 靶序列變異：11.長(zhǎng)片段的變性、退火和延伸與常規(guī)PCR有所不同，一般要長(zhǎng)一些，尤其是DNA聚合酶對(duì)于DNA單鏈的延伸時(shí)間。長(zhǎng)片段PCR和普通PCR在不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的情況基本上是一樣的。這里根據(jù)長(zhǎng)片段PCR的情況寫(xiě)的，有些地方不適用于常規(guī)PCR。 樓主的情況是長(zhǎng)片段PCR不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，原因與解決方法如下： 下面是尋找原因并且針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析原因與相應(yīng)的對(duì)策，最后寫(xiě)出了調(diào)整順序�！� 一、原因及相應(yīng)的對(duì)策： 1. DNA模板不純，混入了雜質(zhì)：(1)模板中含有雜蛋白質(zhì)。(2)模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，此時(shí)A260/A280>1.8。(3)DNA模板溶液吸入了酚或者SDS。對(duì)策：重新提取DNA模板，去除蛋白質(zhì)（比如：用Tris-HCl+飽和酚抽提DNA，DNA融于水相，同時(shí)變性沉淀蛋白質(zhì)位于水相與苯酚相之間，可用吸管吸走變性沉淀蛋白質(zhì)層，接著棄去苯酚相，最后用乙醇沉淀DNA）和小分子（透析、超濾等）。長(zhǎng)片段PCR的模板用量一般是100pg-2ug。而且長(zhǎng)片段PCR的DNA模板的純度要求一般比常規(guī)的PCR要更一些，所以反應(yīng)前應(yīng)該充分提純。 2. DNA模板發(fā)生了降解：反復(fù)凍融或者長(zhǎng)期在冰箱的冷藏箱里，導(dǎo)致降解。使用凝膠電泳檢驗(yàn)DNA模板是否存在降解，即有有明顯彌散帶出現(xiàn)。如果DNA模板存在降解則用為降解的DNA模板，或者重新提取DNA模板。 3. 需要增加DNA聚合酶的專一性。 現(xiàn)在已經(jīng)有多種商用的長(zhǎng)片段PCR的DNA聚合酶可以選擇使用。首先選擇質(zhì)量好的商用的長(zhǎng)片段PCR的DNA聚合酶。商用的長(zhǎng)片段PCR的DNA聚合酶的添加劑不同于常規(guī)的PCR，一般不添加BSA，而加入30-100mmol/L的二甲基亞砜，100-150mmol/L的甘油，50-150g/L的PEG6000, 50-150mmol/L的甲酰胺，約5ug/L的大腸桿菌DNA單鏈結(jié)合蛋白，10-100mmol/L的氯化四乙銨，約0.1g/L的明膠等，每次加一種，別都加進(jìn)去。也可以根據(jù)試劑盒的商業(yè)說(shuō)明操作加入添加劑。注意加入時(shí)分梯度進(jìn)行。 4. 緩沖溶液：最好都是新配置的，類別濃度要正確別加錯(cuò)了，這步可能是太基本很不被注意。 5. 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不 理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：(1)選定一個(gè)好的引物合成單位。(2)引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，需要調(diào)整引物的濃度，在反應(yīng)時(shí)加入濃度基本相同的引物。(3)引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。(4)引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。（5）在引物的Tm范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性問(wèn)題可以大大減少引物與模板的非特異性的結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。（6）引物3’末端用GC可以增加PCR的專一性擴(kuò)增�！� 6. Mg2+ 濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。Mg2+ 濃度一般可能與的dNTP濃度存在同方向偶聯(lián)效應(yīng)。如果是長(zhǎng)片段PCR，更不同的產(chǎn)品試劑盒對(duì)于Mg2+ 濃度進(jìn)行調(diào)整。 在長(zhǎng)片段PCR中Mg2+ 濃度一般比常規(guī)的Mg2+ 濃度高，一般是2-6mmol/L，可以分梯度調(diào)整。也有高達(dá)10mmol/L和低至1mmol/L的，可以根據(jù)試劑盒的商家說(shuō)明加以梯度調(diào)整。 7. 反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20μL、30μL、50μL或100μL，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20μL 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。具體反應(yīng)體積根據(jù)長(zhǎng)片段PCR試劑盒的說(shuō)明確定。 8. 物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。沒(méi)有重新設(shè)計(jì)引物，不要大范圍地變動(dòng)反應(yīng)體系的復(fù)性溫度，要在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)變動(dòng)�！ � 9. 靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。這需要重新設(shè)計(jì)引物。 10.長(zhǎng)片段PCR適宜使用熱啟動(dòng)或者降落PCR。 11.長(zhǎng)片段的變性、退火和延伸與常規(guī)PCR有所不同，一般要長(zhǎng)一些，尤其是DNA聚合酶對(duì)于DNA單鏈的延伸時(shí)間。DNA聚合酶的延伸時(shí)間大致根據(jù)每分鐘1000bp的聚合酶的速率來(lái)計(jì)算后確定，要保證每次延伸時(shí)間都?jí)駾NA聚合酶完全聚合完畢DNA單鏈。 一般三階段熱循環(huán)法的溫度和時(shí)間為：92-97度需時(shí)間15 s-1min,60-67度 需時(shí)間約1min，68-69度需時(shí)間約5-20 min。共循環(huán)25-30次。 首次變性溫度和時(shí)間為：93-94度，2min，終末延伸溫度和時(shí)間：68-69度，需時(shí)間約7 min. 具體參數(shù)根據(jù)具體的長(zhǎng)片段PCR試劑盒的要求而作具體調(diào)整。 |
16樓2013-11-11 00:05:20
2樓2013-10-23 16:04:49
serhhrr
鐵蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 195.5
- 帖子: 21
- 在線: 26.6小時(shí)
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- 注冊(cè): 2011-10-26
- 性別: GG
- 專業(yè): 微生物資源與分類學(xué)
3樓2013-10-23 16:52:20
taccycle
銅蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 14 (小學(xué)生)
- 金幣: 112.9
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- 蟲(chóng)號(hào): 2364578
- 注冊(cè): 2013-03-21
- 性別: GG
- 專業(yè): 遺傳學(xué)研究新技術(shù)與方法
4樓2013-10-23 17:17:02
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[考研] 復(fù)試調(diào)劑 +4 | z1z2z3879 2026-03-14 | 5/250 |
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