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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 大片段PCR擴增求助
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serhhrr鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
大片段PCR擴增求助 已有4人參與
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| 我需要做一個RTPCR,擴增未知目的條帶，大小約為3000bp，循環(huán)體系如下：94℃ 30s，54-60℃ 30s ， 72℃ 3-4min。酶的話用過LA Taq，Taq酶都用過，也換人操作過，可一直P不出來，求助各位高手��！ |
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一葦杭之xmc
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5樓2013-10-23 17:27:47
凌波麗
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【答案】應助回帖
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樓主的情況是長片段PCR不出現(xiàn)擴增條帶。我剛剛根據(jù)樓主的情況寫了一份參考資料，樓主可以參考。與所有的我過去回答過的常規(guī)PCR的問題與解答都不同。 長片段PCR不出現(xiàn)擴增條帶的原因和對策 2013-11-10 PCR反應的主要的關鍵環(huán)節(jié)有:1.模板DNA的質量，2.模板DNA的長度過大，2.需要增加DNA聚合酶的專一性，3.緩沖溶液變質需要更換，3.引物的質量，4. 緩沖溶液，5. 引物，5.Mg2+ 濃度，6. Mg2+ 濃度，6.反應體積的改變，7. 反應體積的改變，8.物理原因，9.靶序列變異，10. 靶序列變異：11.長片段的變性、退火和延伸與常規(guī)PCR有所不同，一般要長一些，尤其是DNA聚合酶對于DNA單鏈的延伸時間。長片段PCR和普通PCR在不出現(xiàn)擴增條帶的情況基本上是一樣的。這里根據(jù)長片段PCR的情況寫的，有些地方不適用于常規(guī)PCR。 樓主的情況是長片段PCR不出現(xiàn)擴增條帶，原因與解決方法如下： 下面是尋找原因并且針對上述環(huán)節(jié)進行分析原因與相應的對策，最后寫出了調整順序�！� 一、原因及相應的對策： 1. DNA模板不純，混入了雜質：(1)模板中含有雜蛋白質。(2)模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，此時A260/A280>1.8。(3)DNA模板溶液吸入了酚或者SDS。對策：重新提取DNA模板，去除蛋白質（比如：用Tris-HCl+飽和酚抽提DNA，DNA融于水相，同時變性沉淀蛋白質位于水相與苯酚相之間，可用吸管吸走變性沉淀蛋白質層，接著棄去苯酚相，最后用乙醇沉淀DNA）和小分子（透析、超濾等）。長片段PCR的模板用量一般是100pg-2ug。而且長片段PCR的DNA模板的純度要求一般比常規(guī)的PCR要更一些，所以反應前應該充分提純。 2. DNA模板發(fā)生了降解：反復凍融或者長期在冰箱的冷藏箱里，導致降解。使用凝膠電泳檢驗DNA模板是否存在降解，即有有明顯彌散帶出現(xiàn)。如果DNA模板存在降解則用為降解的DNA模板，或者重新提取DNA模板。 3. 需要增加DNA聚合酶的專一性。 現(xiàn)在已經(jīng)有多種商用的長片段PCR的DNA聚合酶可以選擇使用。首先選擇質量好的商用的長片段PCR的DNA聚合酶。商用的長片段PCR的DNA聚合酶的添加劑不同于常規(guī)的PCR，一般不添加BSA，而加入30-100mmol/L的二甲基亞砜，100-150mmol/L的甘油，50-150g/L的PEG6000, 50-150mmol/L的甲酰胺，約5ug/L的大腸桿菌DNA單鏈結合蛋白，10-100mmol/L的氯化四乙銨，約0.1g/L的明膠等，每次加一種，別都加進去。也可以根據(jù)試劑盒的商業(yè)說明操作加入添加劑。注意加入時分梯度進行。 4. 緩沖溶液：最好都是新配置的，類別濃度要正確別加錯了，這步可能是太基本很不被注意。 5. 引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：(1)選定一個好的引物合成單位。(2)引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，需要調整引物的濃度，在反應時加入濃度基本相同的引物。(3)引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。(4)引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。（5）在引物的Tm范圍內，選擇較高的復性問題可以大大減少引物與模板的非特異性的結合，提高PCR反應的特異性。（6）引物3’末端用GC可以增加PCR的專一性擴增�！� 6. Mg2+ 濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。Mg2+ 濃度一般可能與的dNTP濃度存在同方向偶聯(lián)效應。如果是長片段PCR，更不同的產(chǎn)品試劑盒對于Mg2+ 濃度進行調整。 在長片段PCR中Mg2+ 濃度一般比常規(guī)的Mg2+ 濃度高，一般是2-6mmol/L，可以分梯度調整。也有高達10mmol/L和低至1mmol/L的，可以根據(jù)試劑盒的商家說明加以梯度調整�！ � 7. 反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20μL、30μL、50μL或100μL，應用多大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20μL 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。具體反應體積根據(jù)長片段PCR試劑盒的說明確定。 8. 物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。沒有重新設計引物，不要大范圍地變動反應體系的復性溫度，要在引物的Tm少5-10度的范圍內變動�！ � 9. 靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。這需要重新設計引物。 10.長片段PCR適宜使用熱啟動或者降落PCR。 11.長片段的變性、退火和延伸與常規(guī)PCR有所不同，一般要長一些，尤其是DNA聚合酶對于DNA單鏈的延伸時間。DNA聚合酶的延伸時間大致根據(jù)每分鐘1000bp的聚合酶的速率來計算后確定，要保證每次延伸時間都夠DNA聚合酶完全聚合完畢DNA單鏈。 一般三階段熱循環(huán)法的溫度和時間為：92-97度需時間15 s-1min,60-67度 需時間約1min，68-69度需時間約5-20 min。共循環(huán)25-30次。 首次變性溫度和時間為：93-94度，2min，終末延伸溫度和時間：68-69度，需時間約7 min. 具體參數(shù)根據(jù)具體的長片段PCR試劑盒的要求而作具體調整。 |
16樓2013-11-11 00:05:20
2樓2013-10-23 16:04:49
serhhrr
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4樓2013-10-23 17:17:02
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http://www.baidupcs.com/file/170 ... ;to=wb&fm=B,B,T,t&expires=8h&rt=pr&r=434070297&logid=3557013314&fn=A%20new%20protocol%20for%20highly%20efficient.pdf 這里有篇文章講長鏈擴增的，用到兩種酶混用。不知道對你有沒有幫助。 |
6樓2013-10-23 18:12:28
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10樓2013-10-25 09:03:43
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