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serhhrr鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
大片段PCR擴(kuò)增求助 已有4人參與
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| 我需要做一個RTPCR,擴(kuò)增未知目的條帶，大小約為3000bp，循環(huán)體系如下：94℃ 30s，54-60℃ 30s ， 72℃ 3-4min。酶的話用過LA Taq，Taq酶都用過，也換人操作過，可一直P不出來，求助各位高手��！ |
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 核酸生物學(xué)實驗經(jīng)驗 |
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一葦杭之xmc
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5樓2013-10-23 17:27:47
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【答案】應(yīng)助回帖
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樓主的情況是長片段PCR不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。我剛剛根據(jù)樓主的情況寫了一份參考資料，樓主可以參考。與所有的我過去回答過的常規(guī)PCR的問題與解答都不同。 長片段PCR不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的原因和對策 2013-11-10 PCR反應(yīng)的主要的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有:1.模板DNA的質(zhì)量，2.模板DNA的長度過大，2.需要增加DNA聚合酶的專一性，3.緩沖溶液變質(zhì)需要更換，3.引物的質(zhì)量，4. 緩沖溶液，5. 引物，5.Mg2+ 濃度，6. Mg2+ 濃度，6.反應(yīng)體積的改變，7. 反應(yīng)體積的改變，8.物理原因，9.靶序列變異，10. 靶序列變異：11.長片段的變性、退火和延伸與常規(guī)PCR有所不同，一般要長一些，尤其是DNA聚合酶對于DNA單鏈的延伸時間。長片段PCR和普通PCR在不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的情況基本上是一樣的。這里根據(jù)長片段PCR的情況寫的，有些地方不適用于常規(guī)PCR。 樓主的情況是長片段PCR不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，原因與解決方法如下： 下面是尋找原因并且針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析原因與相應(yīng)的對策，最后寫出了調(diào)整順序�！� 一、原因及相應(yīng)的對策： 1. DNA模板不純，混入了雜質(zhì)：(1)模板中含有雜蛋白質(zhì)。(2)模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，此時A260/A280>1.8。(3)DNA模板溶液吸入了酚或者SDS。對策：重新提取DNA模板，去除蛋白質(zhì)（比如：用Tris-HCl+飽和酚抽提DNA，DNA融于水相，同時變性沉淀蛋白質(zhì)位于水相與苯酚相之間，可用吸管吸走變性沉淀蛋白質(zhì)層，接著棄去苯酚相，最后用乙醇沉淀DNA）和小分子（透析、超濾等）。長片段PCR的模板用量一般是100pg-2ug。而且長片段PCR的DNA模板的純度要求一般比常規(guī)的PCR要更一些，所以反應(yīng)前應(yīng)該充分提純。 2. DNA模板發(fā)生了降解：反復(fù)凍融或者長期在冰箱的冷藏箱里，導(dǎo)致降解。使用凝膠電泳檢驗DNA模板是否存在降解，即有有明顯彌散帶出現(xiàn)。如果DNA模板存在降解則用為降解的DNA模板，或者重新提取DNA模板。 3. 需要增加DNA聚合酶的專一性。 現(xiàn)在已經(jīng)有多種商用的長片段PCR的DNA聚合酶可以選擇使用。首先選擇質(zhì)量好的商用的長片段PCR的DNA聚合酶。商用的長片段PCR的DNA聚合酶的添加劑不同于常規(guī)的PCR，一般不添加BSA，而加入30-100mmol/L的二甲基亞砜，100-150mmol/L的甘油，50-150g/L的PEG6000, 50-150mmol/L的甲酰胺，約5ug/L的大腸桿菌DNA單鏈結(jié)合蛋白，10-100mmol/L的氯化四乙銨，約0.1g/L的明膠等，每次加一種，別都加進(jìn)去。也可以根據(jù)試劑盒的商業(yè)說明操作加入添加劑。注意加入時分梯度進(jìn)行。 4. 緩沖溶液：最好都是新配置的，類別濃度要正確別加錯了，這步可能是太基本很不被注意。 5. 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增，對策為：(1)選定一個好的引物合成單位。(2)引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，需要調(diào)整引物的濃度，在反應(yīng)時加入濃度基本相同的引物。(3)引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。(4)引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。（5）在引物的Tm范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性問題可以大大減少引物與模板的非特異性的結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。（6）引物3’末端用GC可以增加PCR的專一性擴(kuò)增�！� 6. Mg2+ 濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。Mg2+ 濃度一般可能與的dNTP濃度存在同方向偶聯(lián)效應(yīng)。如果是長片段PCR，更不同的產(chǎn)品試劑盒對于Mg2+ 濃度進(jìn)行調(diào)整。 在長片段PCR中Mg2+ 濃度一般比常規(guī)的Mg2+ 濃度高，一般是2-6mmol/L，可以分梯度調(diào)整。也有高達(dá)10mmol/L和低至1mmol/L的，可以根據(jù)試劑盒的商家說明加以梯度調(diào)整�！ � 7. 反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20μL、30μL、50μL或100μL，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20μL 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。具體反應(yīng)體積根據(jù)長片段PCR試劑盒的說明確定。 8. 物理原因：變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計，檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。沒有重新設(shè)計引物，不要大范圍地變動反應(yīng)體系的復(fù)性溫度，要在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)變動。 9. 靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會成功的。這需要重新設(shè)計引物。 10.長片段PCR適宜使用熱啟動或者降落PCR。 11.長片段的變性、退火和延伸與常規(guī)PCR有所不同，一般要長一些，尤其是DNA聚合酶對于DNA單鏈的延伸時間。DNA聚合酶的延伸時間大致根據(jù)每分鐘1000bp的聚合酶的速率來計算后確定，要保證每次延伸時間都夠DNA聚合酶完全聚合完畢DNA單鏈。 一般三階段熱循環(huán)法的溫度和時間為：92-97度需時間15 s-1min,60-67度 需時間約1min，68-69度需時間約5-20 min。共循環(huán)25-30次。 首次變性溫度和時間為：93-94度，2min，終末延伸溫度和時間：68-69度，需時間約7 min. 具體參數(shù)根據(jù)具體的長片段PCR試劑盒的要求而作具體調(diào)整。 |
16樓2013-11-11 00:05:20
2樓2013-10-23 16:04:49
serhhrr
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4樓2013-10-23 17:17:02
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http://www.baidupcs.com/file/170 ... ;to=wb&fm=B,B,T,t&expires=8h&rt=pr&r=434070297&logid=3557013314&fn=A%20new%20protocol%20for%20highly%20efficient.pdf 這里有篇文章講長鏈擴(kuò)增的，用到兩種酶混用。不知道對你有沒有幫助。 |
6樓2013-10-23 18:12:28
happy361
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7樓2013-10-24 08:46:31
lgd19891003
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8樓2013-10-24 23:25:12
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9樓2013-10-24 23:47:41
laojiu9878
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