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serhhrr鐵蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
大片段PCR擴(kuò)增求助 已有4人參與
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| 我需要做一個(gè)RTPCR,擴(kuò)增未知目的條帶，大小約為3000bp，循環(huán)體系如下：94℃ 30s，54-60℃ 30s ， 72℃ 3-4min。酶的話(huà)用過(guò)LA Taq，Taq酶都用過(guò)，也換人操作過(guò)，可一直P(pán)不出來(lái)，求助各位高手��！ |
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凌波麗
專(zhuān)家顧問(wèn) (知名作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
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長(zhǎng)片段PC不同于一般PCR的特殊要求： 1.用Taq-LA DNA聚合酶，該酶是Taq酶或Klentaq 1（無(wú)糾錯(cuò)功能）與pfu酶或Deep Vent酶（有糾錯(cuò)功能）的混合物，以Taq酶為主。 2.當(dāng)需要擴(kuò)增的片段大于20kd時(shí)，需要加入高濃度的甜茶堿（終濃度為1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶堿加入后，要將擴(kuò)增反應(yīng)的溫度降低2-3度。樓主的擴(kuò)增片段還到不了2020kd,甜茶堿可以少加點(diǎn)。 3.適當(dāng)升高鎂離子濃度，不要太高了鎂離子濃度高于底物dNTP濃度即可。 4.變性時(shí)間要短，尤其是一般不超過(guò)30 s，尤其是模板長(zhǎng)度超過(guò)8KD時(shí)更是如此，變性時(shí)間長(zhǎng)會(huì)破壞模板。 5.延伸溫度可以下降為68攝氏度，同時(shí)加長(zhǎng)延伸反應(yīng)時(shí)間，長(zhǎng)度為3-5kd的模板延伸反應(yīng)時(shí)間為5-10分鐘，長(zhǎng)度為20-35kd的模板延伸反應(yīng)時(shí)間為20分鐘，樓主的PCR的延伸反應(yīng)時(shí)間可能為12-16分鐘左右。 6.模板濃度最好在1ng/L以?xún)?nèi)。 7.應(yīng)用長(zhǎng)片段PCR緩沖溶液。10X長(zhǎng)片段PCR緩沖溶液組成為：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸銨，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。 8.設(shè)計(jì)較長(zhǎng)的PCR引物（25-30 bp)。 我今天的回答比過(guò)去的同類(lèi)問(wèn)題的回答要簡(jiǎn)便，應(yīng)該更容易操作一些。 |
19樓2014-07-08 01:58:07
2樓2013-10-23 16:04:49
serhhrr
鐵蟲(chóng) (初入文壇)
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3樓2013-10-23 16:52:20
taccycle
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4樓2013-10-23 17:17:02
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