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夏天的普洱茶木蟲 (著名寫手)
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[求助]
難道這個問題真的沒有人遇到過嗎？ 已有1人參與
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最近在做畢赤酵母表達，pGAPZ ALHPA A這個載體，菌株是SMD1168H。篩選以后提了酵母基因組，PCR也擴到了條帶，但是問題出現(xiàn)了，這些菌落在平板上是有酶活的，試了三種底物，都證明在平板上有酶活。但是液體發(fā)酵，試了YPDS,YEPG,YNB BMGW培養(yǎng)基，碳源用了Lactose,glucose,sorbitol,從第一天開始搖瓶，測了21天沒測到酶活，不存在沒有分泌的可能，因為胞外胞內(nèi)全測了。折騰了快半年了，老板說他從來沒遇到過這種情況，我就想知道，難道真的沒有人遇到過么？ 對了，還濃縮了上清，做了SDS-PAGA 和HIS-TAG INVISION STAIN，全都彌散，沒有條帶。如果真沒壓根就沒產(chǎn)蛋白，那平板上三種不同底物的酶活是哪里來的？ |
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lomis
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【答案】應(yīng)助回帖
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kx444555: 金幣+3, 鼓勵交流 2015-04-10 09:21:59
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1. 你確定平板上沒有干擾因素干擾顯色？ 2. 在平板上即使有酶活，不說明是分泌的，因為如果你的底物是小分子，在胞內(nèi)表達的也可以顯色，平板顯色本身來說是一個很靈敏的篩選方法，一點點的酶就可以（大部分單個菌落的表達量足以顯色），即使是瞬時表達的，也可以顯色。而你在發(fā)酵液中表達后可能測試的時候已降解。 3. 如果是我，因為時間是有限的，我會更換載體或宿主，如果還是一樣情況，則不用酵母表達，更換其他宿主。 |
3樓2015-04-10 08:50:35
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4樓2015-04-10 09:27:25
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5樓2015-04-10 09:31:56
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