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ggyy0911鐵蟲 (正式寫手)
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[求助]
畢赤酵母電轉(zhuǎn)后在平板上單克隆應(yīng)該太小太密，難以篩選怎么辦？ 已有1人參與
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我這幾次做的pPIC9k電轉(zhuǎn)GS115，電轉(zhuǎn)后涂的RDB板，長出來的菌落非常的小而且密，搞的就很難把它影印到MM和MD板上進(jìn)行篩選，很難標(biāo)記。 我看我同門的是稀稀落落幾顆一個(gè)平板上，感覺她的又太少了，因?yàn)槭謨陨弦话闶呛Y選100個(gè)左右，她一個(gè)平板就6、7個(gè)的樣子。 我之后還打算在MD和MM上篩選Mut+和Muts，再上G418平板，因?yàn)橹按嬖谥挥蠷DB板上的菌可以表達(dá)，轉(zhuǎn)到其他板上后就無法表達(dá)的情況，所以最好在篩選后還能對應(yīng)上最初的RDB平板上的菌落。 我用Sac I線性化的9k，因?yàn)槔碚撋喜迦際IS區(qū)（即用Sal I）的話只產(chǎn)生Mut+，而有文獻(xiàn)說對于大分子量蛋白Muts更適合表達(dá)。表達(dá)手冊上說Sac I也應(yīng)該只產(chǎn)生Mut+，可是看了很多文獻(xiàn)還是進(jìn)行了Mut+和Muts的篩選。 |
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新蟲 (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
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樓主你要是濃度太高，可以刮下來，用無菌水稀釋再重新涂布，這樣會好很多。 我現(xiàn)在在也做一個(gè)類似的實(shí)驗(yàn)，對于理論上是mut+型，為什么還要做這一個(gè)篩選，我也一直有這個(gè)疑問。。難道是突變了，因?yàn)樗鼈兓蛏嫌?7%的同源性。。？ 共勉之  引用操作手冊上的原話： 畢赤酵母中有兩個(gè)基因編碼醇氧化酶－AOX1 及 AOX2。細(xì)胞中大多數(shù)的醇氧化酶是 AOX1 基因產(chǎn)物。甲醇可緊密調(diào)節(jié)、誘導(dǎo) AOX1 基因的高水平表達(dá)，較典型的是占可溶性 蛋白的 30%以上。AOX1 基因已被分離，含 AOX1 啟動(dòng)子的質(zhì)�？捎脕泶龠M(jìn)編碼外源蛋白 的目的基因的表達(dá)。AOX2 基因與 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中帶 AOX2 基因 的菌株比帶 AOX1 基因菌株慢得多，通過這種甲醇利用緩慢表型可分離 Muts 菌株。AOX1 突變表型： 缺失 AOX1 基因，會喪失大部分的醇氧化酶活性，產(chǎn)生一種表型為 Muts 的突變株 （methanol utilization slow），過去稱為 Mut，而 Muts 可更精確地描述突變子的表型。結(jié)果 細(xì)胞代謝甲醇的能力下降，因而在甲醇培養(yǎng)基中生長緩慢。Mut + （methanol utilization plus） 指利用甲醇為唯一碳源的野生型菌株。這兩種表型用來檢測外源基因在畢赤酵母轉(zhuǎn)化子中的 整合方式。 |
2樓2015-06-04 09:27:07
ggyy0911
鐵蟲 (正式寫手)
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你的方法真是簡單粗暴，我喜歡，確實(shí)之前沒想到……我后來轉(zhuǎn)化涂了不同菌液量的板，菌落少的那個(gè)板一樣是長不大，我看網(wǎng)上有人說這是轉(zhuǎn)化效率低，所以才小，所以在考慮用很久以前一篇文獻(xiàn)提的那個(gè)高效酵母感受態(tài)制備方法。我最近做表達(dá)一直做不出來，各種糾結(jié)。至于mut和muts，我覺得做MM和MD似乎是沒有意義的，因?yàn)槲液Y選的時(shí)候很明顯有的在MM上偏小，但用通用引物驗(yàn)證都是mut，所以我認(rèn)為應(yīng)該以pcr驗(yàn)證為準(zhǔn)。希望咱倆能多交流交流～ [ 發(fā)自小木蟲客戶端 ] |
3樓2015-06-04 13:28:35
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你好，我的跟你一樣，涂抗性平板，長出來的白色一層，很小很密集，根本沒辦法挑單菌落。后來我又重新轉(zhuǎn)化涂MD平板篩選，結(jié)果一樣，且未轉(zhuǎn)化酵母涂MD的陰性對照也是這樣，樓主你問題解決了嗎？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2017-06-24 20:23:57
gaiyin1002
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5樓2018-11-26 10:40:40
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