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baiyangnjau木蟲 (正式寫手)
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[求助]
亞細(xì)胞定位前后不一致，請幫忙分析原因，具體問題如下，謝謝！ 已有3人參與
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| 半年前構(gòu)建了目的蛋白-GFP的融合蛋白（GFP在C端，做亞細(xì)胞定位，我是做植物的，用的是煙草瞬時表達(dá)，一直做的結(jié)果是線粒體定位，已經(jīng)下了結(jié)論認(rèn)為是線粒體定位，最近又順帶看了一下，結(jié)果麻煩大了，顯示的是膜定位，做了好幾次都這樣，重新提質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌煙草表達(dá)還是膜定位，又把GFP連到我的蛋白的N端，也是這樣，怎么辦��？感覺要瘋了，請各位多多提出自己的看法，非常感謝！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
baiyangnjau: 金幣+100, 謝謝您的幫忙！ 2015-04-20 12:59:39
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baiyangnjau: 金幣+100, 謝謝您的幫忙！ 2015-04-20 12:59:39
| 首先，檢查你用的農(nóng)桿菌，看看有沒可能被污染了。其次，膜信號很可能是自發(fā)熒光，現(xiàn)在你的融合蛋白很可能沒有很好地表達(dá)，有條件最好做WB驗(yàn)證一下表達(dá)，另外也可能需要考慮重新準(zhǔn)備一批農(nóng)桿菌。再次，你做定位有沒用合適的marker，最好把marker共轉(zhuǎn)進(jìn)去作對照。 |
4樓2015-04-19 22:39:13
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8樓2015-04-20 16:17:56
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另外，線粒體蛋白也存在可能表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。我對這塊不熟悉，但感覺可能有這幾個方面可以考慮，第一，你做的蛋白是否為細(xì)胞質(zhì)合成再轉(zhuǎn)入線粒體，那就可以解釋為什么細(xì)胞質(zhì)中可以看到，對于這個情況，我感覺是否改變農(nóng)桿菌侵染后觀察時間，給蛋白足夠時間運(yùn)到線粒體內(nèi)。其次，有些線粒體膜蛋白好像有轉(zhuǎn)運(yùn)識別肽段，可以讓這些蛋白進(jìn)出線粒體，不知道有沒有做相關(guān)分析的網(wǎng)站，你可以查查看。再次，線粒體基質(zhì)蛋白不一定只在線粒體基質(zhì)中表達(dá)，它們也可以在線粒體外表達(dá)，可能有什么機(jī)制影響這個。 另外做個廣告，有興趣歡迎加入我辦的植物生理群 |
9樓2015-04-20 16:34:28
baiyangnjau
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10樓2015-04-20 21:56:17
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