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[交流]
8.5kD小分子蛋白WB一直沒(méi)出條帶 已有2人參與
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目標(biāo)蛋白加上flag標(biāo)簽有8.5kD左右。 首先表達(dá)載體是常見的pcDNA3.1，重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序分析沒(méi)有任何問(wèn)題。 轉(zhuǎn)染時(shí)用帶EGFP的載體做對(duì)照，效率不高，20-30%左右。 SDS-PAGE分離膠濃度15%，濃縮膠5%，70-80V溴酚藍(lán)帶跑到分離膠1/4處，換110-120V跑到分離膠2/3處。 轉(zhuǎn)膜用BIO-RAD的0.2um PVDF膜，天能的系統(tǒng)，濕轉(zhuǎn)180mA 90min，也用過(guò)90V（電流200左右）60min。 有用預(yù)染marker，至少75kD的帶可以完全轉(zhuǎn)到膜上。5%脫脂奶粉（GenStar）封閉1h-2h。 anti-flag一抗1:1000-2000稀釋，4度過(guò)夜，二抗2h。ECL發(fā)光。 曝光時(shí)間最長(zhǎng)1000s，都是鬼都沒(méi)看見。 孵過(guò)anti-EGFP的一抗，轉(zhuǎn)染EGFP對(duì)照組出了很正常的條帶，基本證實(shí)載體的表達(dá)和轉(zhuǎn)染過(guò)程沒(méi)問(wèn)題。 以β-actin做內(nèi)參，自動(dòng)曝光0.5s就有條帶。 然后目標(biāo)蛋白一直沒(méi)出來(lái)…… 更煩躁的是拿去另個(gè)實(shí)驗(yàn)室做，BIO-RAD系統(tǒng)，sigma抗體還是沒(méi)有條帶…… 求大神指條明路_(:з」∠)_ |
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heyefeifei15
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2樓2015-08-16 00:27:13
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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3樓2015-08-16 00:59:39
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