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耀曜512銀蟲 (初入文壇)
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[求助]
求一分 蛋白質(zhì)電泳詳細過程 還有需要的溶液 已有2人參與
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想做蛋白質(zhì)電泳試驗 但是我們實驗室只有 DNA電泳的一些藥品還有儀器 瓊脂糖凝膠 EB染色 求一份蛋白質(zhì)電泳的 詳細步驟 還有所需藥品 |
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2樓2014-10-14 17:28:31
耀曜512
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3樓2014-10-15 13:24:10
圓yy
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【答案】應(yīng)助回帖
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實驗用試劑 低分子量蛋白Maker TAKARA 4*上樣緩沖 TAKARA Pagn Blue protein staining solution Fermentas 試劑的配制 1. 貯液的配制 （1） 凝膠儲液 取30g丙烯酰胺+0.8g甲叉雙丙烯酰胺0.8g ,先用35ml雙蒸水溶解，攪拌，直到溶液變成透明，再用雙蒸水稀釋至100ml，過濾。棕色瓶4℃保存一個月。 （2）1 mol/l Tris-HCL (PH 8.8) 12.1g Tris(三羥甲基氨基甲烷)溶解在80ml雙蒸水中，用4mol/l鹽酸調(diào)PH至8.8。再用雙蒸水稀釋至100ml，保存在4℃冰箱。 （3）1.0 mol/l Tris-HCL (PH 6.8) 6.06g Tris溶解在40ml雙蒸水中，用用4mol/l鹽酸調(diào)PH至6.8。再用雙蒸水稀釋至50ml，保存在4℃冰箱。 （4）10%過硫酸銨（APS） 0.1g過硫酸銨+1ml雙蒸水。使用前新鮮配制 （5）Tris–甘氨酸電泳緩沖液的配制（25mmol/L Tris；250mmol/L甘氨酸(pH8.3)） 30.3gTris+ 144.2g甘氨酸+ 10gSDS，雙蒸水定容至1L。 每次使用時10倍稀釋。 （6） 樣品緩沖液 使用4*SDS-PAGE loading buffer(Takara公司)，上樣緩沖與樣品比例1:3混勻，之后煮沸5min。 2. 凝膠的配制 溶液成分 分離膠12.5% 10ml 濃縮膠4% 5ml H2O 2.05 3.51 凝膠儲液 4.15 0.835 1.0mol/l Tris-Hcl(PH8.8) 3.75 --- 1.0mol/l Tris-Hcl(PH6.8) --- 0.625 10%SDS溶液 0.08 0.06 10%過硫酸銨 0.1 0.1 TEMED 0.01 0.006 注：上表所標體積為配制兩塊膠的用量。若配制一塊或多塊，可按比例減半或加倍。 具體步驟如下： 1、樣品制備：40 μL蛋白+5*上樣緩沖液10 μL，煮沸5 min，冷卻后放冰箱下層保存，備用 2、制膠 1） 用專用的醫(yī)用棉口罩將膠板擦拭干凈，電泳槽清洗干凈，組裝模具。 注：必須使用專用的棉口罩擦拭膠板，且輕輕的向一個方向擦拭，以免劃壞膠板。 膠板和電泳槽未清洗干凈，會影響電泳效果。 2） 按上表成分配制分離膠，迅速搖勻，沿膠的一邊，迅速灌入分離膠，注意勿打入氣泡，迅速水封。 3） 放置1 h。 4） 傾去蒸餾水，用濾紙將未倒干凈的水吸干。 5） 按上表成分配制濃縮膠，迅速搖勻，沿膠的一邊，迅速灌入濃縮膠，注意勿打入氣泡，迅速插入齒梳。 6） 放置1h。 注：新配置的凝膠，室溫放置5h，使膠充分凝聚、混勻，之后再使用，效果更好。忌馬上電泳。 3、配制電泳緩沖及上樣 取配好的10*電泳緩沖130ml，用蒸餾水稀釋至1300ml。 將制好的凝膠用電泳夾固定至電泳槽中。注：短板朝里。若只跑一塊膠，電泳夾的對面也必須放置一塊電泳板。 倒入電泳緩沖液，液面至短板和長板之間。 每孔上樣量最大20ul。蛋白Maker上樣量7ul。 4、 電泳 80V 45min;120V 45min。 注：若120v 45min后，溴酚藍指示劑前沿距離電泳板下端太遠，可延長電泳時間，或適當增加電壓，待跑至距電泳板下端1cm時停止電泳。 5、 剝膠 剝膠過程必須浸在蒸餾水中進行。 6、 水洗 電泳結(jié)束后，用蒸餾水洗膠三次，每次10min。 7、 染色 將膠至于脫色搖床上，使用考馬斯亮藍染色液（fermentas公司）過夜染色。 注：考馬斯亮藍染色液的使用，請嚴格按照染色液說明上的操作步驟進行。 考馬斯亮藍染液可重復利用3次，使用一次的染液請倒回使用一次的回收瓶中，使用過兩次的染色液倒回使用兩次的回收瓶中，用滿三次才可廢棄。 8、 脫色洗 脫色液洗脫3次，每次1小時，洗去背景色。拍照。 9、 清洗膠板和電泳槽。 注：清洗和擦拭膠板時，請使用專用的醫(yī)用棉口罩清洗，用水沖洗時，輕輕擦拭，將殘留的膠清洗干凈，注意不要太用力，以免劃壞膠板。洗好后，放置專用的膠架上晾干，晾干后放入相應(yīng)的膠盒中。 10、 清理實驗臺，將實驗儀器擺放整齊。 希望對你有用 |
4樓2014-10-15 14:29:23
耀曜512
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5樓2014-10-16 09:15:58
6樓2014-10-16 17:12:53
nyjznj2010
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7樓2014-10-17 11:41:16
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