實(shí)驗(yàn)用試劑
低分子量蛋白Maker    TAKARA
4*上樣緩沖 TAKARA
Pagn Blue protein staining solution Fermentas
試劑的配制
1. 貯液的配制
（1）凝膠儲(chǔ)液
取30g丙烯酰胺+0.8g甲叉雙丙烯酰胺0.8g ,先用35ml雙蒸水溶解，攪拌，直到溶液變成透明，再用雙蒸水稀釋至100ml，過(guò)濾。棕色瓶4℃保存一個(gè)月。
（2）1 mol/l Tris-HCL (PH 8.8)
12.1g Tris(三羥甲基氨基甲烷)溶解在80ml雙蒸水中，用4mol/l鹽酸調(diào)PH至8.8。再用雙蒸水稀釋至100ml，保存在4℃冰箱。
（3）1.0 mol/l Tris-HCL (PH 6.8)
6.06g Tris溶解在40ml雙蒸水中，用用4mol/l鹽酸調(diào)PH至6.8。再用雙蒸水稀釋至50ml，保存在4℃冰箱。
（4）10%過(guò)硫酸銨（APS）
0.1g過(guò)硫酸銨+1ml雙蒸水。使用前新鮮配制
（5）Tris–甘氨酸電泳緩沖液的配制（25mmol/L Tris；250mmol/L甘氨酸(pH8.3)）
30.3gTris+ 144.2g甘氨酸+ 10gSDS，雙蒸水定容至1L。每次使用時(shí)10倍稀釋。
（6）樣品緩沖液
使用4*SDS-PAGE loading buffer(Takara公司)，上樣緩沖與樣品比例1:3混勻，之后煮沸5min。
2. 凝膠的配制
溶液成分分離膠12.5% 10ml             濃縮膠4% 5ml
  H2O 2.05                                     3.51
凝膠儲(chǔ)液 4.15                                        0.835
1.0mol/l Tris-Hcl(PH8.8) 3.75            ---
1.0mol/l Tris-Hcl(PH6.8) ---                0.625
10%SDS溶液 0.08                                  0.06
10%過(guò)硫酸銨 0.1                                     0.1
TEMED 0.01                                           0.006
注：上表所標(biāo)體積為配制兩塊膠的用量。若配制一塊或多塊，可按比例減半或加倍。
具體步驟如下：
1、樣品制備：40 μL蛋白+5*上樣緩沖液10 μL，煮沸5 min，冷卻后放冰箱下層保存，備用
2、制膠
1）用專(zhuān)用的醫(yī)用棉口罩將膠板擦拭干凈，電泳槽清洗干凈，組裝模具。
注：必須使用專(zhuān)用的棉口罩擦拭膠板，且輕輕的向一個(gè)方向擦拭，以免劃壞膠板。
膠板和電泳槽未清洗干凈，會(huì)影響電泳效果。
2）按上表成分配制分離膠，迅速搖勻，沿膠的一邊，迅速灌入分離膠，注意勿打入氣泡，迅速水封。
3）放置1 h。
4）傾去蒸餾水，用濾紙將未倒干凈的水吸干。
5）按上表成分配制濃縮膠，迅速搖勻，沿膠的一邊，迅速灌入濃縮膠，注意勿打入氣泡，迅速插入齒梳。
6）放置1h。
注：新配置的凝膠，室溫放置5h，使膠充分凝聚、混勻，之后再使用，效果更好。忌馬上電泳。
3、配制電泳緩沖及上樣
取配好的10*電泳緩沖130ml，用蒸餾水稀釋至1300ml。
將制好的凝膠用電泳夾固定至電泳槽中。注：短板朝里。若只跑一塊膠，電泳夾的對(duì)面也必須放置一塊電泳板。
倒入電泳緩沖液，液面至短板和長(zhǎng)板之間。
每孔上樣量最大20ul。蛋白Maker上樣量7ul。
4、電泳
80V 45min;120V 45min。
注：若120v 45min后，溴酚藍(lán)指示劑前沿距離電泳板下端太遠(yuǎn)，可延長(zhǎng)電泳時(shí)間，或適當(dāng)增加電壓，待跑至距電泳板下端1cm時(shí)停止電泳。
5、剝膠
剝膠過(guò)程必須浸在蒸餾水中進(jìn)行。
6、水洗
電泳結(jié)束后，用蒸餾水洗膠三次，每次10min。
7、染色
將膠至于脫色搖床上，使用考馬斯亮藍(lán)染色液（fermentas公司）過(guò)夜染色。
注：考馬斯亮藍(lán)染色液的使用，請(qǐng)嚴(yán)格按照染色液說(shuō)明上的操作步驟進(jìn)行。
考馬斯亮藍(lán)染液可重復(fù)利用3次，使用一次的染液請(qǐng)倒回使用一次的回收瓶中，使用過(guò)兩次的染色液倒回使用兩次的回收瓶中，用滿(mǎn)三次才可廢棄。
8、脫色洗
脫色液洗脫3次，每次1小時(shí)，洗去背景色。拍照。
9、清洗膠板和電泳槽。
注：清洗和擦拭膠板時(shí)，請(qǐng)使用專(zhuān)用的醫(yī)用棉口罩清洗，用水沖洗時(shí)，輕輕擦拭，將殘留的膠清洗干凈，注意不要太用力，以免劃壞膠板。洗好后，放置專(zhuān)用的膠架上晾干，晾干后放入相應(yīng)的膠盒中。
10、清理實(shí)驗(yàn)臺(tái)，將實(shí)驗(yàn)儀器擺放整齊。

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