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[交流]
酵母雙雜交 已有6人參與
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本人最近在做酵母雙雜，用Y187和AH109菌株，轉(zhuǎn)質(zhì)粒PGBKT7和PGADT7.用的是熱激轉(zhuǎn)化方法： 1) 在1.5 mL預(yù)冷的離心管中加入100 ng轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒（誘餌載體）DNA和10 μL已變性的10mg/mL的鯡魚精DNA（Herring testes Carrier DNA）并充分混勻； 2) 加入100 μL酵母感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻； 3) 加入600 μL PEG/LiAc溶液，輕輕震蕩混勻后置于30℃熱板上30 min，每10 min搖勻一次； 4) 加入70 μL DMSO，輕輕點到混勻； 5) 42℃熱板上15 min，每5 min搖勻一次； 6) 冰上放置1-2min，12000 rpm離心15 s，去上清； 7) 加入1 mL YPD Plus Liquid Medium，高速離心15 s，去上清； 8) 加入1 mL 0.9% NaCl溶液，涂布于一缺平板SD/-Trp上，30℃培養(yǎng)，2-3天 現(xiàn)在出現(xiàn)的問題是SD/-Trp不長，轉(zhuǎn)了好多次都不行，求有經(jīng)驗的朋友指導(dǎo)一二，不甚感激啦！ |
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kx444555: 金幣+2, 鼓勵交流 2015-06-24 12:16:21
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
kx444555: 金幣+2, 鼓勵交流 2015-06-24 12:16:21
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你好，我是根據(jù)clontech的說明書上來操作的，但酵母一直搖不起來。第一步挑一個酵母單菌落在YPDA液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)8—12hr能長起來，可是在第二步轉(zhuǎn)移5ul到新的YPDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)16—20hr卻總是不到規(guī)定的OD值。 有一次劃線保存，發(fā)現(xiàn)在YPDA固體培養(yǎng)基上，AH109菌株變紅，但相同的板上另一側(cè)的Y187沒有變紅，難道是菌株老化變異嗎？可是后來從別的實驗室借來GOLD菌株仍然搖不起來。。。 這個問題已經(jīng)困擾我很久了，耽誤了兩個月的時間，希望您能幫我分析一下，不勝感激！ |
3樓2015-06-23 18:43:55
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2樓2015-05-24 08:54:57
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4樓2015-06-23 21:40:36
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