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111玲瓏鎮(zhèn)新蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助GR-DTNB循環(huán)法測定谷胱甘肽庫的一些問題
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| 最近在測植物組織中谷胱甘肽庫的量,采用的是分光光度計(jì)測定412nm處的吸光值;驹硗珿SH測定,在此基礎(chǔ)上加入GR酶將GSSG還原成GSH,循環(huán)反復(fù)致使產(chǎn)物TNB增加,吸光值增加。方法中寫GSH和GSSG交替,總量不變。要測定3min時(shí)的吸光值,有的測定的是4min時(shí)的吸光值,想問為什么是3或4min,這個(gè)時(shí)間是怎么確定的?我在測定時(shí)發(fā)現(xiàn)3min后吸光值還是在增加的,但一定時(shí)間后開始下降。已經(jīng)做了谷胱甘肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線,是將3min時(shí)的吸光值帶入還是將3min內(nèi)吸光值的變化率帶入求得的是谷胱甘肽庫?求大神幫忙答疑解惑,小生不勝感激! |
金蟲 (正式寫手)
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測定總巰基含量時(shí),15 mg蛋白樣品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 緩沖液(0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0)。測定自由巰基含量時(shí),15 mg樣品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 緩沖液中,而后加入50 μL Ellman 試劑 (DTNB, 即5,5-二硫基雙2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 緩沖液,4 mg/mL),在25℃條件下保溫反應(yīng)60 min, 離心(5000 g, 15 min),上清液在412 nm 處測定吸光值,以含Ellman 試劑的Tris-Gly 緩沖液為空白對(duì)照。 巰基含量的計(jì)算公式如下: SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C 式中:A —除去試劑空白后樣品的吸光度值 D—稀釋倍數(shù) C—樣品濃度(mg/mL) 問題1:上述公式中稀釋倍數(shù)D是怎么算的(具體的式子),如果完全按照上述方法是不是就是1? 問題2:我測的物質(zhì)為毛發(fā)固體樣品,二硫鍵含量在350μmol/g附近,此種測試方法是否具有可行性 問題3:由于毛發(fā)樣品中含有非水溶性蛋白,又沒喲測量二硫鍵含量的更好的方法 |

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