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肉肉肉.鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
有關(guān)信號(hào)肽的很多疑惑 已有2人參與
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大家好，本人剛接觸分子生物，很多基礎(chǔ)的東西都不太明白，請(qǐng)各位大神賜教啊！ 就是我要把一個(gè)真核微生物的蛋白表達(dá)到酵母ppic9k這個(gè)質(zhì)粒上去，因?yàn)槲液罄m(xù)要研究這個(gè)蛋白的性質(zhì)，所以想蛋白可以分泌至胞外，為了后續(xù)純化方便，要利用His標(biāo)簽純化蛋白。 1、現(xiàn)在ppic9k這個(gè)質(zhì)粒上面有a分泌信號(hào)肽，但是我用網(wǎng)站分析了一下我的目的蛋白完整的CDS區(qū)域，發(fā)現(xiàn)它自身也有信號(hào)肽，結(jié)果是這樣，我有點(diǎn)看不懂 # Measure Position Value Cutoff signal peptide? max. C 18 0.554 max. Y 18 0.685 max. S 1 0.922 mean S 1-17 0.824 D 1-17 0.760 0.450 YES Name=Sequence SP='YES' Cleavage site between pos. 17 and 18: VVA-QP D=0.760 D-cutoff=0.450 Networks=SignalP-noTM 然后我想問的是，他自身有信號(hào)肽的話，我想這個(gè)蛋白最后可以分泌至胞外，我是要利用它自身的信號(hào)肽分泌呢，還是利用ppic9k這個(gè)質(zhì)粒上的a分泌信號(hào)肽呢？ 2、如果只能利用質(zhì)粒上面的a分泌信號(hào)肽的話，是不是還要去除我的目的蛋白片段上面的信號(hào)肽序列呢？但是怎么去除呢？具體操作是依靠設(shè)計(jì)引物來(lái)做嗎？ 3、我看很多文獻(xiàn)上面都是采用的第一個(gè)酶切位點(diǎn)，這種選擇是偶然的還是說(shuō)一定要這么選的？是為了在用kex2酶切位點(diǎn)切掉a分泌信號(hào)肽之后可以少表達(dá)前面多出來(lái)的幾個(gè)氨基酸序列嗎？我如果選的是第二個(gè)酶切位點(diǎn)EcoR1和最后一個(gè)Not1可以嗎？會(huì)對(duì)表達(dá)后的蛋白質(zhì)的性質(zhì)產(chǎn)生影響嗎？ 跪求各位大神賜教�。。。。。�！ |
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 蛋白表達(dá)純化鑒定精華 |
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8樓2016-01-04 16:30:46
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10樓2016-01-04 22:38:15
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2樓2015-06-02 12:57:53
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【答案】應(yīng)助回帖
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肉肉肉.: 金幣+15 2015-06-02 17:16:40
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1、要在酵母中分泌表達(dá)的話，利用ppic9k這個(gè)質(zhì)粒上的a分泌信號(hào)肽，而不是你目的蛋白本身帶的信號(hào)肽，因?yàn)樵撔盘?hào)肽酵母不一定識(shí)別。 2、去除你的目的蛋白片段上游的信號(hào)肽序列，因?yàn)檫@是成熟蛋白不需要的，具體方法就是你說(shuō)的設(shè)計(jì)引物，從第18個(gè)氨基酸的編碼序列開始擴(kuò)增。 3、不一定要采用的第一個(gè)酶切位點(diǎn)，用后面的酶切位點(diǎn)對(duì)分泌表達(dá)沒有影響，可能的影響就是N端多了幾個(gè)氨基酸殘基，具體對(duì)表達(dá)后的蛋白有沒有影響，因不同的蛋白而異，沒有規(guī)律，所以建議，做了再說(shuō)。 |
3樓2015-06-02 17:09:57
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4樓2015-06-02 17:16:30
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【答案】應(yīng)助回帖
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前兩點(diǎn)樓上大神已經(jīng)說(shuō)的很清楚了，至于第三點(diǎn)我再稍微補(bǔ)充一下：蛋白因?yàn)檫B接原因?qū)е略诙瞬慷喑鰩讉�(gè)氨基酸目前一般認(rèn)為和原始蛋白是一致的，測(cè)出來(lái)的性質(zhì)也是可以被公認(rèn)的。但不保證這些氨基酸一定不會(huì)對(duì)蛋白產(chǎn)生影響。一般表達(dá)的蛋白只要不出非常明顯的問題，這個(gè)因素可以忽略，當(dāng)然也和你研究目標(biāo)相關(guān)！~ 如果你想用蛋白自帶的信號(hào)肽也沒有任何問題，把α信號(hào)肽替換掉，直接從ATG開始將你的全場(chǎng)基因連接上就可以。但是考慮到rbs、和kozak 序列的優(yōu)化，去除α信號(hào)肽等問題，如果剛接觸分子實(shí)驗(yàn)的話，建議還是用酵母α信號(hào)肽來(lái)做比較穩(wěn)妥。 關(guān)于你說(shuō)的那篇用自身信號(hào)肽進(jìn)行分泌的文章，可否分享一下，我看看他是咋做的~ |
5樓2015-06-02 19:01:47
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http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00253-011-3246-y 這篇文章里面談到成功分泌出來(lái)過(guò)哎大神！第18個(gè)氨基酸開始把他pcr出來(lái)的話，要加上ATG嗎，好像不需要吧 |
6樓2015-06-02 19:08:26
luwei13566
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7樓2015-06-02 19:19:21
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