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[求助]
WB無目的條帶，actin是正常的。 已有7人參與
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我想要的目的蛋白是鳥氨酸脫羧酶（ODC，51 kDa，位于胞漿），我搜了相關(guān)文獻(xiàn)，該蛋白做WB并沒有對(duì)于還原或非還原，變性或非變性的特殊要求，其中有一篇的各方面操作寫的非常詳細(xì)，也沒有考慮變性或者還原的問題。故，我的實(shí)驗(yàn)步驟都是很常規(guī)的方法。嘗試了兩家公司的一抗，兩種細(xì)胞株HepG2和A549（說明書上條帶很亮），上樣量50ug。 我每次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果都可以用下邊的圖來表示，即β-actin很清晰，幾乎背景顏色，目的蛋白部位無任何條帶。 第一家公司的一抗已經(jīng)退貨，第二家是Abcam的，已經(jīng)交了投訴表。 提取蛋白：買的全蛋白提取試劑盒（含有裂解液，各種酶抑制劑等），按照說明書做的； 蛋白電泳：網(wǎng)上搜的最常規(guī)的配方（有SDS），步驟； 轉(zhuǎn)膜：由Marker可以看出，非常清晰； 封閉：5% 脫脂奶粉，1h，室溫； 一抗：兔源，5% 脫脂奶粉溶液，12h，4℃； 二抗：鼠抗兔，TBST溶液，1h，室溫； 顯影：ECL，天能的儀器，最大曝光5min。 綜上，無目的條帶的原因，除了一抗有問題，是否還有其他可以改進(jìn)的地方？謝謝各位了，這實(shí)驗(yàn)我從5.1放假前的周末開始做，直到現(xiàn)在，嘗試了各種條件  。WB圖片-可見光下與ECL試劑顯色后 |
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你可以嘗試增加曝光時(shí)間，或者減少抗體稀釋倍數(shù)，有可能這種蛋白含量較少，不好檢測(cè)。 [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
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http://www.abcam.com/ornithine-d ... r5724-ab126590.html abcam這個(gè)貨號(hào)吧，看起來這個(gè)抗體還是比較靠譜的，建議提高一抗?jié)舛仍囋? |
6樓2015-07-30 23:07:18
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| 你的抗體都是兔緣的嗎？如果是，那一定是抗體有問題。除此之外，你有蛋白標(biāo)樣的話就上一個(gè)標(biāo)樣馬上能檢測(cè)到問題，actin是housekeeping gene，保守性很高，所以很容易檢測(cè)，而你的目的蛋白可能穩(wěn)定性不高，酶確實(shí)如此，所以極有可能在你處理的過程中就降解掉了。最后一點(diǎn)就是這個(gè)酶可能表達(dá)量低，其實(shí)50ug的loading已經(jīng)很高了，不過你可以嘗試更高，上到100。 |
7樓2015-07-31 05:51:36
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8樓2015-08-02 13:15:47
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1.你的蛋白根本沒有表達(dá)或表達(dá)的量很少，檢測(cè)不到。 2.你的蛋白量太少，轉(zhuǎn)膜沒轉(zhuǎn)上，建議100V，100min。（這個(gè)條件我易反復(fù)試過很多次，沒問題） 3.轉(zhuǎn)膜后用麗春紅染色看一下是否有蛋白，如果沒有你就不需要進(jìn)行下面的步驟了。（有些時(shí)候，蛋白量很少 麗春紅染色也顯示不出來，這個(gè)方法就不適用） |
9樓2015-08-03 12:53:55
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actin沒問題, 說明你流程沒問題. 可能是1抗、不同隻2抗、照相曝光時(shí)間或是蛋白表達(dá)量不足...等. 沒用過的目標(biāo)抗體, 最好搜尋paper用過的抗體. 買同一隻?硎褂鎂筒粫?huì)有問題. 說明書....通常很不準(zhǔn)!!!!! 蛋白量表現(xiàn)除了你的細(xì)胞會(huì)不會(huì)表現(xiàn)或表現(xiàn)量多寡或是需要誘導(dǎo)表現(xiàn)... 也是要了解一下喔~ |
10樓2015-08-03 13:20:02
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