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[求助]
雙酶切 已有5人參與
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我現(xiàn)在想把目的基因構(gòu)建到表達(dá)載體PET-30a中，選用的酶是Ecor1和Xho1，使用的Takara的快切酶。我是先將目的片段構(gòu)建至PMD-18中，然后再同表達(dá)載體同時做雙酶切，但每次T載體中目的片段可以切下來，但表達(dá)載體卻切不開，不知道是怎么回事，時間、反應(yīng)體系都是一樣的。我想問一下，大家用過快切酶嗎？反應(yīng)時間一般都要多久，說明書說5min即可，但每次酶切效果都很弱，即使我延長到2小時，或是增加質(zhì)粒的量，切下來的目的片段條帶也很弱，而載體根本切不下來（載體上兩酶切位點相距33bp)。大家有好的建議嗎？或是遇到過類似的問題嗎？ 我的圖片是TIFF格式，上傳不上來..... |
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7樓2015-06-25 21:21:42
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
雨中飛蝶: 金幣+4, ★★★很有幫助 2015-07-01 14:41:46
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雨中飛蝶: 金幣+4, ★★★很有幫助 2015-07-01 14:41:46
| 兩個酶切位點只是相距33bp，你雙酶切單憑跑膠根本看不出來有沒有同時切開，不嫌麻煩保證連接成功最好就是分別單切，如果要是嫌麻煩想雙切一次，你連接轉(zhuǎn)化的時候就得好好做對照，要不然就是切不開怎么都是自連，你的目的片段切下來濃度低的話就得多切幾管50ul體系至少6管，保證一定濃度，目的片段要是小的話濃度上不去也沒事，因為你載體要是單切2次回收以后濃度也不會太高，在保證載體和目的片段都切開的情況下，多調(diào)節(jié)連接比例一定能行，一定要做好對照！ |
9樓2015-06-26 16:05:55
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2樓2015-06-24 11:21:26
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5樓2015-06-24 16:28:45
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6樓2015-06-25 14:29:34
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8樓2015-06-26 08:31:30
10樓2015-07-01 14:36:51
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