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494750284木蟲 (小有名氣)
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[求助]
鼠胚成纖維細(xì)胞分離
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各位蟲友，最近在分離鼠胚成纖維細(xì)胞MEF，分離細(xì)胞沒問題，但是總沒有我想要的基因型。 背景：A/a （Het型）♂ * A/a （Het）♀，符合孟德爾遺傳定律，其中a/a在出生后幾小時(shí)內(nèi)死亡（的確觀察到，并檢測(cè)到a/a）。 目的：a/a 純合動(dòng)物個(gè)體不可得，無法進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，因此分離a/a型MEF細(xì)胞，補(bǔ)充一下細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果：分離了5、6次接近50個(gè)胚胎，沒有一個(gè)a/a基因型細(xì)胞，但是有A/A。 步驟： 1、短頸處死小鼠，酒精消毒，碘酊消毒，酒精脫碘； 2、打開腹腔，鑷子夾住子宮頸，提起子宮，剪除韌帶等取出子宮； 3、子宮浸泡于PBS，整體清洗3遍； 4、剪開子宮，將胚胎浸泡于PBS中，總體清洗2遍。將每個(gè)胚胎分別置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中（含PBS）； 5、每個(gè)胚胎清洗3遍，每次浸泡約3min，剪刀鑷子獨(dú)立； 6、去除胚胎內(nèi)臟、四肢、頭部，胚體用5ml PBS沖了一遍； 7、組織置于1.5ml EP管中，剪碎。加入1.3ml胰酶，37度消化30min，期間定時(shí)混勻； 8、終止消化，反復(fù)吹打消化液，接種于10cm 培養(yǎng)皿； 9、2-3h后換液； 10、用6中的頭部組織提起DNA，進(jìn)行基因型檢測(cè)。 各位蟲友，我想我一定是忽略了某個(gè)細(xì)節(jié)，請(qǐng)用力敲醒我吧  如果有蟲友做過，麻煩您給我發(fā)一份腹部打開到胚胎剪碎過程中的詳細(xì)步驟，越詳細(xì)越好，可追加200金幣 |
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2樓2015-07-12 09:54:02
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