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[求助]
最近我們課題組做WB總是條帶長短不一，怎么回事��？ 已有4人參與
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| 想問大家做Western blot蟲友們，我最近曝光出來的膠片中，出來的條帶長短不一，我是定量定體積加樣的，怎么會出現(xiàn)這種情況呢？最近我們整個課題組爆出來的膠片都是這樣的，問題會出在哪里呢 ？ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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WB出現(xiàn)非特異性條帶的原因與解決方法 凌波麗 2015年7月16日 1.抗體濃度過高；降低一抗、二抗的濃度，可以分梯度進行。 2.一抗的特異性不足；使用單克隆抗體，單克隆位點的抗原表位是唯一的，多克隆位點的表位不唯一。 3.二抗的非特異性結(jié)合，不加一抗，其他操作不變，即可檢測出二抗的非特異性的條帶是否來自二抗的非特異性結(jié)合；此時需要重新選擇二抗。 4.樣品蛋白質(zhì)上樣量過大；降低上樣量，可以分梯度進行。 5.樣品蛋白質(zhì)發(fā)生了降解，降解產(chǎn)物成為了一抗或二抗的新的抗原，尤其是在一抗或二抗不是單克隆抗體時更為明顯；避免對樣品蛋白質(zhì)反復(fù)凍融，食用新鮮的蛋白質(zhì)樣品，可以使用蛋白酶的廣譜抑制劑（已經(jīng)有商用產(chǎn)品），必要的話使用分子篩層析或HPLC純化蛋白質(zhì)樣品后再上樣（HPLC不能用于蛋白質(zhì)制備，不過用做WB的量還是能夠提供的）。 6.細胞傳代過多，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變異。使用傳代次數(shù)少的細胞的表達的蛋白質(zhì)進行對比，并且作為分子篩層析或HPLC的純化標準，分子篩層析或HPLC能夠分離出構(gòu)象差異的同分異構(gòu)體�？梢栽谏蠘忧�，用紅外、紫外光譜檢測一下，并且對比標準品的數(shù)據(jù)。 7.因為WB的一抗識別的蛋白質(zhì)的表位是順序表位，不是空間表位，所以WB狀態(tài)下的抗原-抗體識別，與非變性的生理條件下的抗原-抗體識別不同。 8.WB之前，先用分子篩純化同時也是檢測一下目的蛋白產(chǎn)物是否成功。也就是目的蛋白是否成功表達了，而且在提取后穩(wěn)定存在了。 9.非特異性的條帶分子量出現(xiàn)可能是SDS PAGE出的問題，膠的濃度不合適或者樣品溶解度不夠或者電泳時間不合適等，造成了目的條帶的表觀質(zhì)量變化。但是如果最終帶與目的蛋白質(zhì)的分子量差距非常大，那么就不是SDSPAGE電泳引起的蛋白質(zhì)的表觀分子量變化的問題了。 10.多個非特異性的分子量不同的帶出現(xiàn)可能是目的蛋白在SDS PAGE電泳出的問題出了問題，也可能本來就是雜帶了。可以回收后對各條帶用質(zhì)譜檢測精確的分子量加以確定。 11.多個非特異性的分子量不同的條帶至少應(yīng)該有雜帶，雜帶出現(xiàn)而且與一抗相互作用，那么只能說雜帶的順序表位也能被一抗識別，必須更換專一性更高的抗體。 12.使是線性表位在“變性蛋白質(zhì)抗原”的折疊態(tài)中也可能會產(chǎn)生空間位阻的問題： （1）因為“變性蛋白質(zhì)抗原”中的線性表位的空間位阻可能不同于“復(fù)性蛋白質(zhì)抗原”的線性表位的空間位阻，這樣“變性蛋白質(zhì)抗原”的線性表位產(chǎn)生的抗體，使得“復(fù)性蛋白質(zhì)抗原”-“變性蛋白質(zhì)的抗體”彼此根本接近不了，而使“變性蛋白質(zhì)的抗體”無法識別“復(fù)性蛋白質(zhì)”的線性表位； （2）可能“變性蛋白質(zhì)的抗體”能夠識別“復(fù)性蛋白質(zhì)”的線性表位，但是由于“變性蛋白質(zhì)”的抗體與“復(fù)性蛋白質(zhì)”的相互作用時由于位阻而導(dǎo)致“變性蛋白質(zhì)”的抗體與“復(fù)性蛋白質(zhì)”的接觸面無法發(fā)生有效的空間形狀的變形契合以及使兩者的接觸面無法發(fā)生電荷有效的互補，從而使得抗原-抗體反應(yīng)不能有效發(fā)生，沒有具體檢測不可以排除這種可能性； 另外一個問題：變性蛋白質(zhì)的抗原的不同于復(fù)性蛋白質(zhì)抗原的折疊態(tài)，未必不會使變性蛋白質(zhì)的抗原有新的線性表位或空間表位形成，變性蛋白質(zhì)的抗原產(chǎn)生的抗體可就復(fù)雜了。 上面說的比較拗口，不知道各位能否看明白，總之，加入了蛋白質(zhì)折疊問題，抗原的線性表位很可能不僅僅與其氨基酸序列相關(guān)。 13.非特異性的蛋白質(zhì)的序列表位與一抗還能夠相互作用。 11、12與13都需要更換專一性更好的單克隆抗體。 |
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倩妮知足3樓2015-07-17 20:31:55
4樓2015-07-18 00:12:59
5樓2015-07-18 00:13:32
fuyuandj86
版主 (著名寫手)
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