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Mercy_新蟲 (初入文壇)
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[求助]
新手請教關(guān)于總RNA提取以及瓊脂糖凝膠電泳的問題！ 已有2人參與
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各位站友們大家好，我在做苜蓿草chs基因的克隆實驗，第一次接觸克隆實驗，在提取總RNA以及電泳驗證其完整性的時候出了很大的問題，提了四天了，每次跑出來的膠都像下面的樣子......詢問了師兄和師姐，他們因為沒做過RNA的實驗所以也不太清楚，小弟在此請教各位大俠了！ RNA長度大約是1.2Kbp 下面是我們的實驗過程： 總RNA提�。� 1.取新鮮的苜蓿草嫩葉分ABCD四組，每組80mg，經(jīng)1 g·L?1 次氯酸鈉消毒15 min 后, 用雙蒸水沖洗干凈, 放置-20℃冰箱保存過夜 2.實驗用研缽用0.1%DEPC水沖洗，放-20℃冰箱預(yù)冷 3.實驗用燒杯、鑷子、刮刀、槍頭、EP管在0.1%DEPC溶液中浸泡過夜，第二天放在37℃的烘箱中烘干。（實驗室只有37℃烘箱......） 4.組織樣本提取：每個樣品加三平勺石英砂，用研缽將組織在-20攝氏度冰箱中磨成粉末，四個樣品分別加1ml Trizol，放置5分鐘 5.每組加0.2ml氯仿，震蕩15秒，室溫靜置2分鐘；4攝氏度，12000轉(zhuǎn)離心15分鐘（配平用石英砂） 6.取水相于新的離心管，加0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘；4攝氏度，12000轉(zhuǎn)離心10分鐘（配平用異丙醇） 7.棄去上清液，加入1.5ml的75%乙醇，渦旋；4攝氏度，12000轉(zhuǎn)離心5分鐘（配平用 75%乙醇） 8.棄去上清液，室溫干燥7分鐘；將RNA溶于10μL的0.1%DEPC水中，-60℃保存過夜 注：所有試劑均用0.1%DEPC水配制，操作過程戴手套和口罩。每次提完總RNA，EP管底部都有很少的白色沉淀，用0.1%DEPC水可以溶解。 RNA跑膠： 1.將制膠用具用75%乙醇沖洗一遍，晾干備用。 2.電泳槽處理：3%H2O2灌滿，室溫放置10分鐘，0.1%DEPC水沖洗。 3.制膠：稱取0.4g瓊脂糖粉末，加入放有29.2mL的DEPC水的錐形瓶中，加熱使瓊脂糖完全溶解。稍冷卻后加入4mL的5xTBE、6.8mL的甲醛，2.5μl Goldview然后在膠槽中灌制凝膠，插好梳子，水平放置待凝固后使用。 4.加樣：在一個DEPC處理過的，干燥的EP管中混合以下試劑：5xTBE2μl、甲醛3.5μL、甲酰胺10μL、RNA樣品3.5μl�；靹�，置60℃保溫10min，冰上速冷。取6μL加樣于凝膠點樣孔內(nèi)。 5.打開電泳儀，100V電泳30分鐘 6.電泳結(jié)束后通過紫外透視儀觀察。 然后跑出來一直都是這樣的......今天下午借了學(xué)長PCR完了多余的DNA（長度大約為750bp），按照完全一樣的電泳條件，和我們提取的放-60℃過夜的RNA一同電泳，結(jié)果還是什么都沒看到，這到底是總RNA提取有問題呢還是瓊脂糖凝膠電泳的問題呢？希望大俠們不吝賜教！ 10000407533376.jpg |
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