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wushenchao新蟲 (初入文壇)
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[交流]
關(guān)于使用TAQMAN絕對(duì)定量的問題，block序列的使用 已有1人參與
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我使用taqman對(duì)質(zhì)粒樣本（某一種特定的突變，進(jìn)行檢測(cè)的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，有假陽性的存在）。具體情況如下 wildtype GGTGGC wildtype GGTGGC G12S AGTGGC G12A GCTGGC G12R CGTGGC G12V GTTGGC G12C TGTGGC G12D GATGGC 由于 1. 本身wildtype與上述突變僅有一個(gè)堿基的差異 2. 上述G12S,G12R,G12C三個(gè)突變型之間也僅僅存在一個(gè)堿基的差異，G12A,G12V,G12D也僅僅存在一個(gè)堿基的差異。導(dǎo)致存在探針錯(cuò)配的可能性（即G12S的質(zhì)粒樣本，單克隆獲取，放入上述所有探針，每個(gè)反應(yīng)孔1種探針）。事實(shí)上我也做了實(shí)驗(yàn)，確實(shí)存在上述情況（G12S的質(zhì)粒樣本共使用8個(gè)孔，每孔放入一種探針，結(jié)果發(fā)現(xiàn)包含有G12C和G12R探針的反應(yīng)孔的熒光值很高，且要顯著高于其他類型的探針，見附件）。 我咨詢了life的技術(shù)，說目前TAQMAN MGB探針也無法達(dá)到精確區(qū)別一個(gè)堿基的程度，也就是特異性也不足夠好，但是如果實(shí)驗(yàn)需要絕對(duì)定量，這部分是避不開的。 我看了其他文獻(xiàn)中提到的情況：To improve probe discrimination, we included nonfluorescent blockers consisting of 3􏰃-phosphate oligonucleotides in each reaction (see Supplemental Methods in the online Data Supplement). In short, the 4-plex assay contains blockers against mutated sequences targeted in the 5-plex panel and the 5-plex assay contains blockers against mutated sequences targeted in the 4-plex panel.（實(shí)際情況就是，分兩管進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，在其中加了探針和引物以外還加了未標(biāo)記熒光但是3‘磷酸化的序列）， 不知道是否有看到過這種用法？能有具體提供的文獻(xiàn)么？life的技術(shù)也說看到過，但是具體如何使用不是很清楚。多謝各位大蝦了 |
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新蟲 (小有名氣)
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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使用Taqman探針進(jìn)行基因突變的熒光定量檢測(cè)，報(bào)告基團(tuán)FAM，淬滅基團(tuán)BHQ。 以10的7次方IU/ml質(zhì)粒為模板，按1%~100%的比例稀釋，但是曲線一直不成線性中間10%~20%這個(gè)比例的CT值一直比32%的小。 前后用了兩個(gè)體系，一個(gè)自己配的，一個(gè)用的Taqman master mix。Taqman master mix曲線很好看，有按比例來，但是產(chǎn)物一直不多。自己配的就是上面說問題，由于實(shí)驗(yàn)需要，我只能用自己配的體系 求前輩指導(dǎo)��！  |
2樓2015-10-23 10:57:24
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