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關于使用TAQMAN絕對定量的問題，block序列的使用 已有1人參與
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我使用taqman對質粒樣本（某一種特定的突變，進行檢測的時候發(fā)現，有假陽性的存在）。具體情況如下 wildtype GGTGGC wildtype GGTGGC G12S AGTGGC G12A GCTGGC G12R CGTGGC G12V GTTGGC G12C TGTGGC G12D GATGGC 由于 1. 本身wildtype與上述突變僅有一個堿基的差異 2. 上述G12S,G12R,G12C三個突變型之間也僅僅存在一個堿基的差異，G12A,G12V,G12D也僅僅存在一個堿基的差異。導致存在探針錯配的可能性（即G12S的質粒樣本，單克隆獲取，放入上述所有探針，每個反應孔1種探針）。事實上我也做了實驗，確實存在上述情況（G12S的質粒樣本共使用8個孔，每孔放入一種探針，結果發(fā)現包含有G12C和G12R探針的反應孔的熒光值很高，且要顯著高于其他類型的探針，見附件）。 我咨詢了life的技術，說目前TAQMAN MGB探針也無法達到精確區(qū)別一個堿基的程度，也就是特異性也不足夠好，但是如果實驗需要絕對定量，這部分是避不開的。 我看了其他文獻中提到的情況：To improve probe discrimination, we included nonfluorescent blockers consisting of 3􏰃-phosphate oligonucleotides in each reaction (see Supplemental Methods in the online Data Supplement). In short, the 4-plex assay contains blockers against mutated sequences targeted in the 5-plex panel and the 5-plex assay contains blockers against mutated sequences targeted in the 4-plex panel.（實際情況就是，分兩管進行多重PCR反應，在其中加了探針和引物以外還加了未標記熒光但是3‘磷酸化的序列）， 不知道是否有看到過這種用法？能有具體提供的文獻么？life的技術也說看到過，但是具體如何使用不是很清楚。多謝各位大蝦了 |
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2樓2015-10-23 10:57:24
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