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nianmo0599新蟲 (初入文壇)
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[求助]
原核表達方面的問題，求各路大神不吝賜教 已有7人參與
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最近在做原核表達，現(xiàn)在已經(jīng)將目的基因與 pet28a連接好并轉(zhuǎn)入了top10，測序正確后提取了質(zhì)粒，下一步準備將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入bl21。 問題就來了，每次做轉(zhuǎn)化都不成功，板子上長滿了克隆，可是挑12個沒有一個是陽性的。::>_<:: 針對這個問題，我也分析了原因，1是感受態(tài)（我后來又用了同學的感受態(tài)，這批感受態(tài)他之前用過，沒問題），2是板子的抗生素（我用這批板子做過其他實驗，也沒問題）3是質(zhì)粒（我又把提出來的這個質(zhì)粒送去了測序，也沒問題）4實驗操作（轉(zhuǎn)化我做過很多次，而且這個轉(zhuǎn)化實驗我也重復了幾次，每次都沒陽性克�。� 問題就是這么個問題，請各路大神幫我分析分析，我第一次做原核表達。（額～本來想發(fā)金幣表示感謝的，可是我窮，就三十個-_-||，所以。。。）請各路大神不吝賜教，先謝謝啦 [ 發(fā)自手機版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
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2樓2015-07-25 11:12:21
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3樓2015-07-25 11:17:11
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【答案】應助回帖
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nianmo0599: 金幣+5 2015-07-26 20:27:03
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那么問題來了，你挑了12個克隆都沒有陽性，你所說的陽性是什么意思？菌落pcr沒結(jié)果？測序不正確？你說長滿了板子，抗性應該是存在的。轉(zhuǎn)化方法？熱激法？電轉(zhuǎn)？建議轉(zhuǎn)化之后培養(yǎng)時間不要太長，能看到菌落就挑克隆進行鑒定，等長滿了板子，板子的抗性可能丟失，產(chǎn)生其他雜菌的可能性也增加。 [ 發(fā)自小木蟲客戶端 ] |
4樓2015-07-25 12:19:49
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