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nianmo0599新蟲 (初入文壇)
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[求助]
原核表達(dá)方面的問題，求各路大神不吝賜教 已有7人參與
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最近在做原核表達(dá)，現(xiàn)在已經(jīng)將目的基因與 pet28a連接好并轉(zhuǎn)入了top10，測(cè)序正確后提取了質(zhì)粒，下一步準(zhǔn)備將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入bl21。 問題就來了，每次做轉(zhuǎn)化都不成功，板子上長(zhǎng)滿了克隆，可是挑12個(gè)沒有一個(gè)是陽性的。::>_<:: 針對(duì)這個(gè)問題，我也分析了原因，1是感受態(tài)（我后來又用了同學(xué)的感受態(tài)，這批感受態(tài)他之前用過，沒問題），2是板子的抗生素（我用這批板子做過其他實(shí)驗(yàn)，也沒問題）3是質(zhì)粒（我又把提出來的這個(gè)質(zhì)粒送去了測(cè)序，也沒問題）4實(shí)驗(yàn)操作（轉(zhuǎn)化我做過很多次，而且這個(gè)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)我也重復(fù)了幾次，每次都沒陽性克隆） 問題就是這么個(gè)問題，請(qǐng)各路大神幫我分析分析，我第一次做原核表達(dá)。（額～本來想發(fā)金幣表示感謝的，可是我窮，就三十個(gè)-_-||，所以。。。）請(qǐng)各路大神不吝賜教，先謝謝啦 [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
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great07225388
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【答案】應(yīng)助回帖
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nianmo0599: 金幣+5 2015-07-26 20:27:03
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那么問題來了，你挑了12個(gè)克隆都沒有陽性，你所說的陽性是什么意思？菌落pcr沒結(jié)果？測(cè)序不正確？你說長(zhǎng)滿了板子，抗性應(yīng)該是存在的。轉(zhuǎn)化方法？熱激法？電轉(zhuǎn)？建議轉(zhuǎn)化之后培養(yǎng)時(shí)間不要太長(zhǎng)，能看到菌落就挑克隆進(jìn)行鑒定，等長(zhǎng)滿了板子，板子的抗性可能丟失，產(chǎn)生其他雜菌的可能性也增加。 [ 發(fā)自小木蟲客戶端 ] |
4樓2015-07-25 12:19:49
wuwuqaz
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