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細(xì)胞轉(zhuǎn)染的原理及步驟 已有3人參與
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轉(zhuǎn)染 ，是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù)。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉(zhuǎn)染目前已成為實(shí)驗(yàn)室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過(guò)物理方法將基因?qū)爰?xì)胞的范例;化學(xué)介導(dǎo)方法很多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽(yáng)離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù);生物介導(dǎo)方法，有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染，和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。 理想細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，是目前轉(zhuǎn)染效率最高的方法，同時(shí)具有細(xì)胞毒性很低的優(yōu)勢(shì)。但是，病毒轉(zhuǎn)染方法的準(zhǔn)備程序復(fù)雜，常常對(duì)細(xì)胞類型有很強(qiáng)的選擇性，在一般實(shí)驗(yàn)室中很難普及。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，則各有其特點(diǎn)。 需要指出的一點(diǎn)，無(wú)論采用哪種轉(zhuǎn)染技術(shù)，要獲得最優(yōu)的轉(zhuǎn)染結(jié)果，可能都需要對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化。影響轉(zhuǎn)染效率的因素很多，從細(xì)胞類型、細(xì)胞培養(yǎng)條件和細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，到轉(zhuǎn)染方法的操作細(xì)節(jié)，都需要考慮。 一、細(xì)胞傳代 1. 試驗(yàn)準(zhǔn)備：200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌)，酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號(hào)筆，培養(yǎng)皿，離心管。 2. 棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。 3. 用tip頭加入1ml Trypsin液，消化1分鐘(37℃，5%CO2 )。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細(xì)胞完全從壁上脫落下來(lái)為止。 4. 加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。 5. 用Tip頭多次吹吸，使細(xì)胞完全分散開。 6. 將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。 7. 用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后選擇0.8X106個(gè)細(xì)胞加入一個(gè)35mm培養(yǎng)皿。 8. 將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細(xì)胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。 9. 將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染。 二、細(xì)胞轉(zhuǎn)染 1. 轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備 ① 將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。 ② 震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存，使用前還需震蕩。 2. 選擇合適的混合比例(1：1-1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量)來(lái)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無(wú)血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。 3. 將混合液在室溫放置10―15分鐘。 4. 吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無(wú)血清培養(yǎng)基清洗一次。 5. 加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。 6. 到時(shí)后，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。 三、第二次細(xì)胞傳代 1. 在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達(dá)情況。 2. 再次進(jìn)行細(xì)胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X105個(gè)細(xì)胞/35mm培養(yǎng)皿將細(xì)胞重新轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中。 3. 在正常條件下培養(yǎng)24小時(shí)后按照染色要求條件固定。 |
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A. 細(xì)胞接種: 1.轉(zhuǎn)染前24小時(shí)左右對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)接，接種密度約為每孔0.3~1×105個(gè)細(xì)胞； 2.過(guò)夜培養(yǎng)。 B. DeofectEU /DNA復(fù)合物包裝(該步完成后應(yīng)立即轉(zhuǎn)染): 1.在1.5 ml無(wú)菌離心管中加入50μl無(wú)血清培養(yǎng)基，并添加適量的轉(zhuǎn)染試劑(2~5μl/μg DNA，參見下表) 。用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5~10分鐘。 2.在1.5 ml無(wú)菌離心管中加入50μl無(wú)血清培養(yǎng)基，并添加適量的DNA (0.8~1μgDNA/孔， 參見附表)。用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5~10分鐘。 3.將DeofectEU-培養(yǎng)基混合物滴加至DNA-培養(yǎng)基混合物中，用移液器輕輕混勻后在室溫靜置15~20分鐘后，立即轉(zhuǎn)染。注意： DeofectEU-培養(yǎng)基混合物和DNA-培養(yǎng)基混合物的混合次序非常重要，切勿顛倒。 C.轉(zhuǎn)染: 注意：DeofectEU 在完全培養(yǎng)基中(基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加血清)具有最高的轉(zhuǎn)染效率，因此轉(zhuǎn)染前后不需要換成無(wú)血清培養(yǎng)基。 1.如特殊情況，可在轉(zhuǎn)染開始之前更換新鮮的含血清培養(yǎng)基，以防轉(zhuǎn)染后孵育階段細(xì)胞密度太大、營(yíng)養(yǎng)不足導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。 2.將步驟B制備的復(fù)合物滴加至培養(yǎng)基中。輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿以使復(fù)合物均勻分布。 3.過(guò)夜培養(yǎng)24~48小時(shí)。 |
4樓2019-03-06 09:08:42
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