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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 生物科學 » 細胞科學 » 細胞轉染的原理及步驟
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細胞轉染的原理及步驟 已有3人參與
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轉染 ，是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉染目前已成為實驗室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過物理方法將基因導入細胞的范例;化學介導方法很多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導的技術;生物介導方法，有較為原始的原生質體轉染，和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導的轉染技術。 理想細胞轉染方法，應該具有轉染效率高、細胞毒性小等優(yōu)點。病毒介導的轉染技術，是目前轉染效率最高的方法，同時具有細胞毒性很低的優(yōu)勢。但是，病毒轉染方法的準備程序復雜，常常對細胞類型有很強的選擇性，在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學介導的轉染方法，則各有其特點。 需要指出的一點，無論采用哪種轉染技術，要獲得最優(yōu)的轉染結果，可能都需要對轉染條件進行優(yōu)化。影響轉染效率的因素很多，從細胞類型、細胞培養(yǎng)條件和細胞生長狀態(tài)，到轉染方法的操作細節(jié)，都需要考慮。 一、細胞傳代 1. 試驗準備：200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌)，酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號筆，培養(yǎng)皿，離心管。 2. 棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。 3. 用tip頭加入1ml Trypsin液，消化1分鐘(37℃，5%CO2 )。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細胞完全從壁上脫落下來為止。 4. 加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應。 5. 用Tip頭多次吹吸，使細胞完全分散開。 6. 將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。 7. 用培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)后選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養(yǎng)皿。 8. 將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。 9. 將培養(yǎng)皿轉入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉染。 二、細胞轉染 1. 轉染試劑的準備 ① 將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。 ② 震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存，使用前還需震蕩。 2. 選擇合適的混合比例(1：1-1：2/脂質體體積：DNA質量)來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉染試劑，再次震蕩。 3. 將混合液在室溫放置10―15分鐘。 4. 吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。 5. 加入混合液，將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。 6. 到時后，根據(jù)細胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。 三、第二次細胞傳代 1. 在轉染后24小時，觀察實驗結果并記錄綠色熒光蛋白表達情況。 2. 再次進行細胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X105個細胞/35mm培養(yǎng)皿將細胞重新轉入培養(yǎng)皿中。 3. 在正常條件下培養(yǎng)24小時后按照染色要求條件固定。 |
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3樓2015-08-26 16:36:14
2樓2015-08-06 11:12:36
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A. 細胞接種: 1.轉染前24小時左右對細胞進行轉接，接種密度約為每孔0.3~1×105個細胞； 2.過夜培養(yǎng)。 B. DeofectEU /DNA復合物包裝(該步完成后應立即轉染): 1.在1.5 ml無菌離心管中加入50μl無血清培養(yǎng)基，并添加適量的轉染試劑(2~5μl/μg DNA，參見下表) 。用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5~10分鐘。 2.在1.5 ml無菌離心管中加入50μl無血清培養(yǎng)基，并添加適量的DNA (0.8~1μgDNA/孔， 參見附表)。用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5~10分鐘。 3.將DeofectEU-培養(yǎng)基混合物滴加至DNA-培養(yǎng)基混合物中，用移液器輕輕混勻后在室溫靜置15~20分鐘后，立即轉染。注意： DeofectEU-培養(yǎng)基混合物和DNA-培養(yǎng)基混合物的混合次序非常重要，切勿顛倒。 C.轉染: 注意：DeofectEU 在完全培養(yǎng)基中(基礎培養(yǎng)基中添加血清)具有最高的轉染效率，因此轉染前后不需要換成無血清培養(yǎng)基。 1.如特殊情況，可在轉染開始之前更換新鮮的含血清培養(yǎng)基，以防轉染后孵育階段細胞密度太大、營養(yǎng)不足導致的細胞死亡。 2.將步驟B制備的復合物滴加至培養(yǎng)基中。輕輕晃動培養(yǎng)皿以使復合物均勻分布。 3.過夜培養(yǎng)24~48小時。 |
4樓2019-03-06 09:08:42
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