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免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)原理、基本步驟及注意事項(xiàng) 已有3人參與
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免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。目前多用精制的proreinA預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的proreinA就能吸附抗原達(dá)到精制的目的。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。 一、試劑準(zhǔn)備 1. 預(yù)冷PBS，RIPA Buffer，細(xì)胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下），離心機(jī)。 2. 用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，最后一次吸干PBS。 3. 加入預(yù)冷的RIPA Buffer(1 ml/107個(gè)細(xì)胞、10 cm培養(yǎng)皿或150 cm2培養(yǎng)瓶，0.5 ml/5×106個(gè)細(xì)胞、6 cm培養(yǎng)皿、75 cm2培養(yǎng)瓶）。 4. 用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5EP管中，4℃，緩慢晃動(dòng)15 min（EP管插冰上，置水平搖床上）。 5. 4℃，14000 g離心15 min，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中。 6. 準(zhǔn)備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠。 7. 每1 ml總蛋白中加入100 μl Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃10 min（EP管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景。 8. 4℃，14000 g離心1 5min，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，去除Protein A珠子。 9． （Bradford 法）做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定蛋白濃度，測(cè)前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20℃保存一個(gè)月）。 10. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細(xì)胞中含量較低，則總蛋白濃度應(yīng)該稍高（如10 μg/μl）。 11. 加入一定體積的兔抗到500 μl總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細(xì)胞系中的多少而異。 12. 4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育。 13. 加入100 μl Protein A瓊脂糖珠來(lái)捕捉抗原抗體復(fù)合物，4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫1 h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 μl"過(guò)渡抗體"（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG）。 14. 14000 rpm瞬時(shí)離心5 s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，去上清，用預(yù)冷的RIPA buffer洗3遍，800 μl/遍，RIPA buffer有時(shí)候會(huì)破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物內(nèi)部的結(jié)合，可以使用PBS。 15. 用60 μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定（60 μl足夠上三道）。 16. 將上樣樣品煮5 min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時(shí)凍-20℃，留待以后電泳，電泳前應(yīng)再次煮5 min變性。 二、免疫共沉淀反應(yīng) 1． 轉(zhuǎn)染后24-48 h 可收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30 min,細(xì)胞裂解液于4°C，最大轉(zhuǎn)速離心30 min后取上清； 2． 取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液加1μg相應(yīng)的抗體加入到細(xì)胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過(guò)夜； 3． 取10 μl protein A 瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3 次，每次3 000 rpm離心3 min； 4.． 將預(yù)處理過(guò)的10μl protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過(guò)夜的細(xì)胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4 h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連； 5． 免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C 以3,000 rpm 速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1 ml裂解緩沖液洗3－4次；最后加入15 μl的2×SDS 上樣緩沖液，沸水煮5分鐘； 6． SDS-PAGE，Western blotting或質(zhì)譜儀分析。 三、通過(guò)免疫共沉淀確定結(jié)合蛋白 1．用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養(yǎng)板上的適宜細(xì)胞。刮去每塊板上的細(xì)胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中； 2．將每毫升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到微量離心管中，在微量離心機(jī)上4℃以最大速度離心15 ； 3．收集上清（約30 ml）并加入30 μg的適當(dāng)抗體，4℃搖動(dòng)免疫沉淀物1 h； 4．加入0.9 ml的蛋白質(zhì)A-Sepharose 懸液，4℃搖動(dòng)免疫沉淀物30 min； 5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重復(fù)洗5次。最后，用NETN洗一次； 6．吸出混合物的液體部分。加入800 μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸4 min； 7．將樣品加入到大孔的不連續(xù)SDS-PAGE梯度膠中，在10 mA的恒定電流下電泳過(guò)夜； 8．通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色觀察蛋白質(zhì)泳帶； 9．從膠上切下目標(biāo)帶，將其放到微量離心管中，用1 ml 50%乙腈洗兩次，每次3 min； 10． 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質(zhì)，再將肽電洗脫； 11． 通過(guò)窄孔高效液相色譜分離肽。將收集的肽在ABI 477A或494A機(jī)器上進(jìn)行自動(dòng)Edman降解測(cè)序。 四、注意事項(xiàng)： 1. 細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40 或Triton X-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定。不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的。 2. 使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用。 3. 使用對(duì)照抗體： 單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗 兔多克隆抗體：正常兔IgG 4. 確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生。 5. 要確保抗體的特異性，即在不表達(dá)抗原的細(xì)胞溶解物中添加抗體后不會(huì)引起共沉淀。 6. 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來(lái)確定。 |
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