 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 3231 | 回復(fù): 3 | |||||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點擊這里查看本話題的所有回帖 | |||||
[交流]
免疫共沉淀實驗原理、基本步驟及注意事項 已有3人參與
|
|||||
|
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。目前多用精制的proreinA預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的proreinA就能吸附抗原達到精制的目的。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。 一、試劑準(zhǔn)備 1. 預(yù)冷PBS，RIPA Buffer，細(xì)胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下），離心機。 2. 用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，最后一次吸干PBS。 3. 加入預(yù)冷的RIPA Buffer(1 ml/107個細(xì)胞、10 cm培養(yǎng)皿或150 cm2培養(yǎng)瓶，0.5 ml/5×106個細(xì)胞、6 cm培養(yǎng)皿、75 cm2培養(yǎng)瓶）。 4. 用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5EP管中，4℃，緩慢晃動15 min（EP管插冰上，置水平搖床上）。 5. 4℃，14000 g離心15 min，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中。 6. 準(zhǔn)備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠。 7. 每1 ml總蛋白中加入100 μl Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃10 min（EP管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景。 8. 4℃，14000 g離心1 5min，將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，去除Protein A珠子。 9． （Bradford 法）做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20℃保存一個月）。 10. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細(xì)胞中含量較低，則總蛋白濃度應(yīng)該稍高（如10 μg/μl）。 11. 加入一定體積的兔抗到500 μl總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細(xì)胞系中的多少而異。 12. 4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育。 13. 加入100 μl Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復(fù)合物，4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫1 h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 μl"過渡抗體"（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG）。 14. 14000 rpm瞬時離心5 s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，去上清，用預(yù)冷的RIPA buffer洗3遍，800 μl/遍，RIPA buffer有時候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物內(nèi)部的結(jié)合，可以使用PBS。 15. 用60 μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定（60 μl足夠上三道）。 16. 將上樣樣品煮5 min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時凍-20℃，留待以后電泳，電泳前應(yīng)再次煮5 min變性。 二、免疫共沉淀反應(yīng) 1． 轉(zhuǎn)染后24-48 h 可收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30 min,細(xì)胞裂解液于4°C，最大轉(zhuǎn)速離心30 min后取上清； 2． 取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液加1μg相應(yīng)的抗體加入到細(xì)胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過夜； 3． 取10 μl protein A 瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3 次，每次3 000 rpm離心3 min； 4.． 將預(yù)處理過的10μl protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細(xì)胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4 h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連； 5． 免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C 以3,000 rpm 速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1 ml裂解緩沖液洗3－4次；最后加入15 μl的2×SDS 上樣緩沖液，沸水煮5分鐘； 6． SDS-PAGE，Western blotting或質(zhì)譜儀分析。 三、通過免疫共沉淀確定結(jié)合蛋白 1．用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養(yǎng)板上的適宜細(xì)胞。刮去每塊板上的細(xì)胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中； 2．將每毫升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到微量離心管中，在微量離心機上4℃以最大速度離心15 ； 3．收集上清（約30 ml）并加入30 μg的適當(dāng)抗體，4℃搖動免疫沉淀物1 h； 4．加入0.9 ml的蛋白質(zhì)A-Sepharose 懸液，4℃搖動免疫沉淀物30 min； 5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重復(fù)洗5次。最后，用NETN洗一次； 6．吸出混合物的液體部分。加入800 μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸4 min； 7．將樣品加入到大孔的不連續(xù)SDS-PAGE梯度膠中，在10 mA的恒定電流下電泳過夜； 8．通過考馬斯亮藍染色觀察蛋白質(zhì)泳帶； 9．從膠上切下目標(biāo)帶，將其放到微量離心管中，用1 ml 50%乙腈洗兩次，每次3 min； 10． 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質(zhì)，再將肽電洗脫； 11． 通過窄孔高效液相色譜分離肽。將收集的肽在ABI 477A或494A機器上進行自動Edman降解測序。 四、注意事項： 1. 細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40 或Triton X-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗確定。不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的。 2. 使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用。 3. 使用對照抗體： 單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗 兔多克隆抗體：正常兔IgG 4. 確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生。 5. 要確保抗體的特異性，即在不表達抗原的細(xì)胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀。 6. 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進行蛋白質(zhì)的定位來確定。 |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 學(xué)習(xí) | 免疫實驗 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
hectorwu» 猜你喜歡
一志愿大連理工大學(xué)材料求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
材料與化工調(diào)劑一志愿大連海事085600，349
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
一志愿中海洋320化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)碩求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
材料科學(xué)與工程調(diào)劑
已經(jīng)有11人回復(fù)
-
311求調(diào)劑一志愿合肥工業(yè)大學(xué)
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
一志愿食品科學(xué)與工程083200求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
材料科學(xué)與工程求調(diào)劑
已經(jīng)有10人回復(fù)
-
一志愿北化085600材料專碩275|有文章專利｜求調(diào)劑
已經(jīng)有11人回復(fù)
-
一志愿 南京航空航天大學(xué) ，080500材料科學(xué)與工程學(xué)碩
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
085600材料與化工調(diào)劑
已經(jīng)有15人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 細(xì)胞轉(zhuǎn)染的原理及步驟
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 細(xì)胞生物學(xué)試題
已經(jīng)有0人回復(fù)
- 抗血清的純化方法
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 上海市博士后基金擬入選名單�。�！
已經(jīng)有16人回復(fù)
- 【分享】蛋白質(zhì)純化個人總結(jié)2
已經(jīng)有38人回復(fù)
4樓2016-04-04 00:07:28
xiaomili1206
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 4 (幼兒園)
- 金幣: 41.8
- 帖子: 48
- 在線: 8.5小時
- 蟲號: 2073200
- 注冊: 2012-10-19
- 專業(yè): 生物化學(xué)
3樓2015-09-09 14:59:16
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 370求調(diào)劑 +3 | 080700調(diào)劑 2026-03-30 | 3/150 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 22408 359分調(diào)劑 +4 | Qshers 2026-03-27 | 7/350 |
|
|
[考研] 調(diào)劑 +4 | GK72 2026-03-30 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 生物學(xué)學(xué)碩，一志愿湖南大學(xué)，初試成績338 +7 | YYYYYNNNNN 2026-03-26 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 367求調(diào)劑 +5 | 芋泥啵啵… 2026-03-28 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 085600 286分 材料求調(diào)劑 +11 | 麻辣魷魚 2026-03-27 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 一志愿廈門大學(xué)材料工程專碩354找調(diào)劑�。�！ +5 | 貝唄鋇鋇 2026-03-30 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 291求調(diào)劑 +8 | HanBeiNingZC 2026-03-24 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 332求調(diào)劑 +6 | Lyy930824@ 2026-03-29 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑，一志愿 南京航空航天大學(xué)大學(xué) ，080500材料科學(xué)與工程學(xué)碩 +6 | @taotao 2026-03-26 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 081200-11408-276學(xué)碩求調(diào)劑 +6 | 崔wj 2026-03-26 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 356求調(diào)劑 +3 | gysy?s?a 2026-03-28 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 343求調(diào)劑 +5 | 愛羈絆 2026-03-28 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 085701環(huán)境工程，267求調(diào)劑 +16 | minht 2026-03-26 | 16/800 |
|
|
|
[考研] 張芳銘-中國農(nóng)業(yè)大學(xué)-環(huán)境工程專碩-298 +4 | 手機用戶 2026-03-26 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 266分求材料化工冶金礦業(yè)等專業(yè)的調(diào)劑 +4 | 哇呼哼呼哼 2026-03-26 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)338求調(diào)劑！ +6 | Zuhui0306 2026-03-26 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 336材料求調(diào)劑 +7 | 陳瀅瑩 2026-03-26 | 9/450 |
|
|
|
[考研]
 085602化學(xué)工程求調(diào)劑。
+4
|
平樂樂樂 2026-03-26 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 材料與化工304求B區(qū)調(diào)劑 +3 | 邱gl 2026-03-25 | 3/150 |
|