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DandelionLS銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
關(guān)于TA克隆的連接，T載體及大腸桿菌JM109的限制修飾系統(tǒng) 已有1人參與
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1.平時(shí)我們?cè)O(shè)計(jì)的引物5’端是非磷酸化的，所以PCR產(chǎn)物在與T載體連接時(shí)相應(yīng)PCR產(chǎn)物5‘端是沒有連接的，這個(gè)地方的缺口要怎么修復(fù)？是依靠宿主的修復(fù)系統(tǒng)？ 2.咱們從公司購(gòu)買的T載體是線性的，未去磷酸化，這樣的話是不是本身就有自連的可能呢？ 3.基因工程中作為制作感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞是否是限制-修飾系統(tǒng)缺陷菌？缺陷程度是什么樣呢？ 4.和第3題差不多同類問題，用大腸桿菌JM109克隆質(zhì)粒，從中提取的質(zhì)粒是否部分序列被甲基化？ 5.利用質(zhì)粒作為模板PCR反應(yīng)產(chǎn)生新的序列，磷酸化自連接后用Dpn1酶切處理，說是除去原來的質(zhì)粒序列，是這樣的嗎？ 注：可能3,4,5為同一類問題。 |
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DandelionLS
銅蟲 (初入文壇)
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3樓2015-08-05 09:57:51
zhaodahe
木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
DandelionLS: 金幣+5, ★★★★★最佳答案 2015-08-05 09:59:45
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1磷酸化酶處理的質(zhì)粒連接后，是在宿主體內(nèi)修復(fù)的。2商品化的T載體自連很多，所以一般都做藍(lán)白篩選。34常用的大腸桿菌菌株是限制修飾系統(tǒng)缺失的，大多存在dam,dcm兩個(gè)甲基化酶，故還有甲基化。5DpnI識(shí)別dam甲基化模式，切割甲基化的序列，故會(huì)切割質(zhì)粒模版，而不切割PCR產(chǎn)物。 [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
2樓2015-08-04 19:00:54
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