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ggyy0911鐵蟲 (正式寫手)
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[求助]
畢赤酵母在篩選板上長的很好，但是PCR鑒定不出來是怎么回事？ 已有3人參與
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我做的GS115，pPIC9k載體還有X33，pPICZαA載體。一個用His缺陷篩選，一個用zeocin濃度篩選。 電轉(zhuǎn)之后兩者都長的很好，甚至zeocin 100ug/ml的板子，之前做電轉(zhuǎn)都沒長幾個，這幾次也長的不錯。G418濃度也篩到0.3mg/ml了。 可是我怎么都鑒定不出來。要不就是好不容易P出來，條帶大小又不是很符合。 通用引物又只P出來了一條帶，所以我完全沒辦法確定到底是怎么回事。 說沒轉(zhuǎn)進去吧，它又長的很好。說轉(zhuǎn)進去了吧，我又P不出來。 我用別人鑒定過的樣品試驗了一下，一端通用一端特異能P出來，但是兩端通用結(jié)果也不好，一條酵母自身，一條空載500bp。 然后PCR了我做電轉(zhuǎn)的線性化質(zhì)粒，也能P出條帶。說明我的質(zhì)粒，酶，體系都沒啥問題吧？ 唯一的解釋就是沒轉(zhuǎn)進去和沒轉(zhuǎn)進去該轉(zhuǎn)的。 沒轉(zhuǎn)進去，那不會長，我做了對照。雖然位轉(zhuǎn)的酵母能在篩選平板上生長，但絕對不會長的這么密，而且個大圓潤飽滿。 沒轉(zhuǎn)進去該轉(zhuǎn)的，我的線性化質(zhì)粒是新鮮的，已測序，從提質(zhì)粒到純化完成會跑兩次膠確定大小。電轉(zhuǎn)期間有什么步驟會讓質(zhì)粒破碎嗎？那我之前做也沒問題呀。 考慮過質(zhì)粒殘留污染，恰好我期間用了一次全新的電擊杯，用這些新電擊杯的樣，同樣存在這種問題。 并且之前也已經(jīng)做了將近10次了，電擊杯也一直重復(fù)利用，沒有這種情況出現(xiàn)。 再做，也不知道該從哪找原因了。求高人救救我吧��！半個月來就死在這了，實在不能相信居然連轉(zhuǎn)三次P不出來。 和從前唯一的區(qū)別是這三次去做我-80凍存過感受態(tài)，最多就凍存了4個小時，因為借的儀器，得配合那邊的時間。但是凍存應(yīng)該只影響轉(zhuǎn)化效率吧，我的板子長的真心是好啊。到底是什么原因?qū)е滤b定不出來呢�。� |
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