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轉(zhuǎn)染實驗要注意的一些問題
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轉(zhuǎn)自 尚尚的博客 http://blog.sina.com.cn/shanghuiqing 轉(zhuǎn)染實驗要注意的一些問題之一 轉(zhuǎn)染——讓克隆的核酸進入真核細胞中，已經(jīng)成為研究和控制真核細胞基因表達的重要手段。比如表達純化特定的蛋白；鑒定一個基因的生物學(xué)特性；突變分析；研究基因表達對細胞生長的影響，研究基因表達的調(diào)控機制等等，等等。如今廣義的轉(zhuǎn)染不單包括了DNA、RNA，還有蛋白質(zhì)等生物大分子。 很多因素會影響轉(zhuǎn)染效率，細胞株本身啦，細胞培養(yǎng)環(huán)境啦，轉(zhuǎn)染的DNA、RNA或者蛋白的質(zhì)量和特性啦，轉(zhuǎn)染方法啦，等等。每個轉(zhuǎn)染高手也必然有自己的獨門心經(jīng)，只可惜大家都為實驗或者生活而疲于奔命，沒有幾個人愿意靜下心情來仔細總結(jié)經(jīng)驗匯集成文字——那些曾經(jīng)用無數(shù)失敗的痛苦煩惱換回來的寶貴經(jīng)驗，那些曾經(jīng)以為會永遠銘刻于腦海的教訓(xùn)，隨時間的流逝而終于漸漸褪色，到模糊。即使偶爾有珠玉掩埋于浩瀚的口水中，也難以匯串成珠。試劑盒的盛行，讓實驗更快，更簡單，也更機械化，相信更多人更愿意先抓起Protocol 123地往下做，直到碰壁再苦思原因。其實等碰得遍體鱗傷回頭一看就會醒悟，很多坑，只要事前注意了就不會陷進去的。 DNA轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)入基因的表達可以在1－4天內(nèi)檢測到——僅有一部分轉(zhuǎn)入細胞的DNA被轉(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄并最終輸出mRNA到細胞質(zhì)進行蛋白合成。幾天內(nèi)，大部分外源DNA會被核酸酶降解或隨細胞分裂而稀釋；一周后就檢測不到其存在了。因此轉(zhuǎn)染也可以分為瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時轉(zhuǎn)染（transient transfection）指的是轉(zhuǎn)染的核酸不整合到染色體上，結(jié)果是短暫的高水平表達，可在24—96小時內(nèi)檢測表達效果，表達水平與位置無關(guān)，不會受到周圍染色體元件的影響。瞬時表達分析所需的人力和時間比穩(wěn)定表達少，但因為DNA攝入效率和表達水平在不同實驗中差異較大，不長久也不穩(wěn)定。超螺旋質(zhì)粒轉(zhuǎn)染更傾向于瞬時表達。瞬時表達適合研究啟動子等調(diào)控元件——不過，誘導(dǎo)型的啟動子除外。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，就是轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA整合到染色體上，或者相當于附加子（episome）可持續(xù)存在，使得轉(zhuǎn)染的細胞可長期表達。外源基因整合的幾率很小，要獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株，通常需要有篩選標記（比如抗性基因）共同轉(zhuǎn)染，通過選擇壓力維持表達的穩(wěn)定——不行的統(tǒng)統(tǒng)槍斃了。質(zhì)粒整合到染色體上本來就是件稀罕事兒，平均萬分之一的幾率，如果是線性化DNA轉(zhuǎn)染，那整合的幾率就高多了。不過怎么整合也就是一個或者有限的幾個拷貝，所以表達量往往比較不高的。但是，“壓倒一切的是'穩(wěn)定'”，很多時候，轉(zhuǎn)染后往往要進行穩(wěn)定表達的篩選。 成功轉(zhuǎn)染第一步：細胞培養(yǎng)注意事項 細胞系的選擇通常不是我們說了算的。有時是實驗的需要，有時是實驗室條件的限制。如果有選擇的余地當然挑個容易做的。越是接近體內(nèi)的真實情況的原代細胞，通常越是難于伺候。反之亦然。此外細胞本身的特性也是需要考慮的因素。有時需要根據(jù)細胞系來選擇合適的轉(zhuǎn)染方法；而有時一些啟動子在不同的細胞系中表現(xiàn)的功能也不同。這些都是設(shè)計實驗時需要考慮的因素，姑且不論。不過因為受限于特定的細胞，如何選擇合適的轉(zhuǎn)染方法就值得考究了。因為不同的細胞可能適用不同的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染條件。如果實驗室已經(jīng)建立了全套方法，照做可也。如果是個新來的細胞株，最好查查資料看哪些成功轉(zhuǎn)染案例。每種轉(zhuǎn)染試劑都會提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細胞株列表和文獻，看看其中是否有你的新對手——這個FuGENE 6 比較有優(yōu)勢，已有750多種細胞系成功轉(zhuǎn)染的資料可供參考。 當實驗進行到轉(zhuǎn)染這一步時需要注意的因素有哪些呢？ 一、健康而茁壯成長的細胞 轉(zhuǎn)染前細胞最好經(jīng)過1—2次傳代，以保證細胞生長旺盛，容易轉(zhuǎn)染。注意，貼壁細胞生長到幾乎匯片時就要趕快進行下一次傳代，千萬不要使細胞保持融合超過24小時，因為一旦長滿了，細胞們就“故步自封”不思轉(zhuǎn)染啦。活力充沛的年輕細胞更容易接受外來的新鮮事物嘛。 大多數(shù)已建立的細胞系都是非整倍體，細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化，這會導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細胞行為的變化。如果隨時間發(fā)現(xiàn)這種變化，融化一管新鮮的細胞可能會恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。比如，新鮮融化的NIH 3T3細胞比傳代8次的細胞表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率（融化細胞的進一步傳代不會馬上降低轉(zhuǎn)染效率）。因此，如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細胞以恢復(fù)最佳結(jié)果。 二、恰到好處的鋪板密度 轉(zhuǎn)染時的細胞密度對轉(zhuǎn)染效率影響非常顯著。不同的轉(zhuǎn)染試劑，要求轉(zhuǎn)染時的最適細胞密度各不相同，即使同一種試劑，也會因不同的細胞類型或應(yīng)用而異。轉(zhuǎn)染時過高或者過低的細胞密度會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低，乃至表達水平偏低。因此如果選用新的細胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑，最好能夠進行優(yōu)化實驗并為以后的實驗建立一個穩(wěn)定方法，包括適當?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時間等等。一般轉(zhuǎn)染時貼壁細胞密度為40%-80%，但這個需要參考所選轉(zhuǎn)染試劑的說明書——陽離子脂質(zhì)體具有微量的細胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細胞數(shù)，有的要求細胞90%匯片；而有些多胺或者非脂質(zhì)體的配方則要求在40%—80%之間，總之是盡量在細胞最適的生理狀態(tài)下轉(zhuǎn)染，以求最佳的轉(zhuǎn)染效果。 不同的實驗?zāi)康囊矔绊戅D(zhuǎn)染時的鋪板密度，比如研究細胞周期相關(guān)基因等表達周期長的基因，就需要較低的鋪板密度，所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進行轉(zhuǎn)染的試劑。需要特別注意。 三、溫暖舒適的培養(yǎng)基 健康的細胞培養(yǎng)是一切成功轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)。不同的細胞類型有不同的特性，需要特定的培養(yǎng)基、血清、補充添加劑等等。 血清 血清一度曾被認為會降低轉(zhuǎn)染效率，老一代的轉(zhuǎn)染方法往往要求轉(zhuǎn)染前后洗細胞或者在無血清培養(yǎng)基條件下轉(zhuǎn)染，對于某些對血清要求敏感的細胞來說是個難題。不過轉(zhuǎn)染產(chǎn)品配方幾經(jīng)革新后的今天，對于主流的轉(zhuǎn)染試劑來說，血清的存在已經(jīng)不會影響轉(zhuǎn)染效率，甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率，比如FuGENE6、Effectene和GeneJuice等。對于多數(shù)可以在有血清條件下工作的轉(zhuǎn)染試劑來說，血清的存在會影響DNA—轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成，但只要在DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成時用無血清培養(yǎng)基來稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑就可以了，在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。這些方便好用、可在有血清條件下轉(zhuǎn)染的試劑包括前面介紹的Lipofectamine2000，F(xiàn)uGENE 6，GeneJuice，Effectene，Polyfect等等。最厲害的是Qiagen的2個產(chǎn)品，Polyfect和Effectene，全程都可以用有血清和抗生素等添加劑的完全培養(yǎng)基來操作，包括稀釋步驟，不用擔心培養(yǎng)基的變化對細胞生長有什么不良影響了。這樣，就不再需要在轉(zhuǎn)染前多次洗細胞，也就減少操作的復(fù)雜程度，更重要的是不必再讓細胞處于無血清的“悲慘環(huán)境”中轉(zhuǎn)染，不必擔心對血清缺乏很敏感的細胞受到不必要的麻煩了。嬌貴的細胞們，你們有福了。不過要特別注意：對于RNA轉(zhuǎn)染，如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關(guān)注的。所以血清的質(zhì)量也是需要關(guān)注的。新加培養(yǎng)基的預(yù)熱對細胞轉(zhuǎn)染很有幫助。 抗生素 支原體、細菌、真菌污染，無論對于細胞培養(yǎng)或者轉(zhuǎn)染都是“不堪回首的痛”，可能會嚴重影響轉(zhuǎn)染結(jié)果，細胞培養(yǎng)過程中往往會添加抗生素來防止污染。但是這些添加劑可能對轉(zhuǎn)染造成麻煩。比如青霉素和鏈霉素，就是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性，使抗生素可以進入細胞。這可能間接導(dǎo)致細胞死亡，造成轉(zhuǎn)染效率低。所以，對于選擇Lipofectamine2000系列轉(zhuǎn)染試劑的實驗，要特別注意在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素，甚至在準備轉(zhuǎn)染前進行細胞鋪板時也要避免使用抗生素。這樣，在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細胞。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因為這些抗生素是GENETICIN選擇性抗生素的競爭性抑制劑。另外，為了保證無血清培養(yǎng)基中細胞的健康生長，使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。這里又要表揚Qiagen的2個產(chǎn)品，Polyfect和Effectene，因為全程都可以用有血清和抗生素等添加劑的完全培養(yǎng)基來操作，很方便的。對于篩選穩(wěn)定表達株，要預(yù)留足夠的時間讓抗性基因表達后再添加篩選壓力。 其他添加物如抗生素，EDTA，檸檬酸鹽，磷酸鹽，RPMI，硫酸軟骨素，透明質(zhì)酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖這些物質(zhì)的存在可能會干擾DNA和轉(zhuǎn)染試劑形成復(fù)合物的過程，要盡量避免。 轉(zhuǎn)染實驗要注意的一些問題之二 一、質(zhì)粒的構(gòu)建：啟動子的選擇 啟動子的選擇對于轉(zhuǎn)染基因的有效表達是非常重要的。對于轉(zhuǎn)染過程本身雖然無甚影響，但是對轉(zhuǎn)染結(jié)果卻有著微妙的影響。 啟動子可分為2大類：誘導(dǎo)型啟動子是比較精明的，平時歇著，一旦接到誘導(dǎo)信號指示就馬上開工干活兒。而組成型啟動子比較老實的，就是從頭到尾不停干活從不閑著的那種——比如我們很熟悉的CMV啟動子啊，SV40啊，pMC1啊，PGK啟動子啊等等。 獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細胞系和要表達的蛋白。CMV啟動子在大多數(shù)細胞類型中可以獲得高表達活性。在BHK-21中，CMV啟動子活性比其他啟動子如SV40和RSV都要高。但這三種病毒啟動子在T細胞來源的細胞系，如Jurkat中組成表達水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat細胞中CMV啟動子，而單PMA就足以激活KG1和K562（人骨髓瘤白細胞）中的CMV啟動子。SV40啟動子的表達在含有大T抗原（存在于COS-1和COS-7）時會提高，因為大T抗原可以刺激染色體外的合成。 一個強悍的高表達組成型啟動子是我們做表達所求之不得的，但是對于轉(zhuǎn)染本身來說卻不一定好——因為任何持續(xù)過高表達外源基因都可能帶來某種程度的細胞毒性，影響細胞生長——如果外源基因本身對細胞生長有毒，那更完蛋了，你很可能篩不到轉(zhuǎn)染成功的細胞株，更別提穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了——因為過量表達本身可能已經(jīng)害死了那個轉(zhuǎn)染了的細胞，沒轉(zhuǎn)染的細胞又死于篩選壓力。這種時候一個不那么“能干”的啟動子可能更適合一些。如果你曾經(jīng)遇到原因不明的轉(zhuǎn)染失敗案例，會不會是這個原因呢？過猶不及就是這個道理咯。 誘導(dǎo)型啟動子對于轉(zhuǎn)染來說，特別是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，可能是更好的選擇。它使得目的基因的表達可以受到我們的調(diào)控——轉(zhuǎn)染的時候不表達，篩選穩(wěn)定表達株后再誘導(dǎo)表達，使得表達有毒性的基因或者精確分析表達產(chǎn)物的生物學(xué)效應(yīng)成為可能。多數(shù)誘導(dǎo)型啟動子在接受某種信號后“打開開關(guān)”開始工作，也有的相反，在缺失某種信號后打開開關(guān)。Clontech還有個誘導(dǎo)系統(tǒng)是“劑量依賴的”，就是說不單表達開關(guān)可控，表達量多少也可以通過誘導(dǎo)劑的量來調(diào)控。還有一種特殊的啟動子很好玩——具有時序性或者組織特異性（空間特異性），會受到特定的元件調(diào)控，在一定的時間或者特定組織細胞中表達的，比如那個轉(zhuǎn)基因山羊奶里用的只在泌乳期的乳腺細胞中表達的啟動子——有人說這是組成型的，我覺得應(yīng)該是誘導(dǎo)型的，只不過誘導(dǎo)的因素我們不知道罷了，這類啟動子在不同的細胞中會有不同的表現(xiàn)，需要注意。誘導(dǎo)系統(tǒng)的問題主要是本底表達，表達量有限，以及誘導(dǎo)劑本身對細胞的影響和如何清除。 轉(zhuǎn)染DNA的啟動子-增強子如果不被宿主細胞識別也會產(chǎn)生無法表達的“悲劇”，這是實驗設(shè)計時需要注意的問題。不過現(xiàn)在利用現(xiàn)成試劑盒或者模擬國外已經(jīng)成功的實驗的居多，獨立構(gòu)建表達系統(tǒng)的極少，因而這種問題遇到的幾率也幾乎可以忽略不計。 目的基因：這個對于研究人員來說是目的，因而沒有選擇的余地。如果你的目的基因正好會影響選定細胞株的生長，甚至有毒，那最好選擇一個誘導(dǎo)型的啟動子，不然你可能總是轉(zhuǎn)染不了。但是通常在實驗之前我們不清楚我們研究的基因產(chǎn)物是否對選定的細胞有毒，所以正負對照很重要。當排除其他原因后轉(zhuǎn)染總是失敗，應(yīng)當從根本上考慮原因。 二、質(zhì)粒的大小和質(zhì)量 線性化還是超螺旋會影響轉(zhuǎn)染結(jié)果：超螺旋質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率比線性DNA高得多，特別是瞬時轉(zhuǎn)染。而線性化DNA轉(zhuǎn)染的整合幾率高。質(zhì)粒太大了轉(zhuǎn)染會困難一些。畢竟，相對致密、較小的外源異物被細胞內(nèi)吞的幾率要大一些。如果你的質(zhì)粒正好比較大，又沒有經(jīng)驗，選擇特別注明可以轉(zhuǎn)大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染試劑成功幾率會高一些。有的轉(zhuǎn)染試劑還會提供一些促進DNA凝聚的成分，使得DNA形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物時更致密一些，更容易轉(zhuǎn)染一些。 純化質(zhì)粒的質(zhì)量無疑會影響轉(zhuǎn)染效率。哺乳動物細胞總歸是比大腸桿菌嬌氣，轉(zhuǎn)染難度高些，因而要求的DNA純度要更高些。早年要做轉(zhuǎn)染真是大陣仗啊，光是提質(zhì)粒做超離就令人皺眉。最令人頭疼的是內(nèi)毒素了。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁上特有的成分，主要是脂多糖中的類脂A（lipopolysaccharides），在細菌被裂解時被釋放出來，由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)和特性，在質(zhì)粒提取的過程中內(nèi)毒素很容易混入質(zhì)粒DNA中共同純化出來。內(nèi)毒素的存在會嚴重地影響轉(zhuǎn)染效率，此外內(nèi)毒素可能會激活造血細胞（例如B細胞、巨嗜細胞等）的非特異免疫反應(yīng)，造成實驗中的假陽性。所以質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染時應(yīng)盡量采用無內(nèi)毒素污染的超純質(zhì)粒。幸好技術(shù)的進步令復(fù)雜的操作成為過去，多數(shù)實驗室會選擇使用轉(zhuǎn)染級別的質(zhì)粒純化試劑盒純化的質(zhì)粒來轉(zhuǎn)染。對于一些“耐受性高、容易操作的”細胞株，普通的Kit已經(jīng)夠了。對于一些對內(nèi)毒素特別敏感的細胞，就要用“去內(nèi)毒素”的質(zhì)粒純化Kit了。Qiagen的Endofree系列可以得到相當于2次CsCl超速離心純度的質(zhì)粒，同時特別設(shè)計去除內(nèi)毒素，專為最嬌氣的細胞系轉(zhuǎn)染和體內(nèi)DNA疫苗而設(shè)計。此外現(xiàn)在Invitrogen和Stratagene都有一些快速純化質(zhì)粒同時也去內(nèi)毒素的Kit，使得去除質(zhì)粒中的內(nèi)毒素更為簡便。 質(zhì)粒DNA的濃度和量：既然質(zhì)粒純化已經(jīng)不成問題，初學(xué)者通常都不會在乎甚至愿意多加點DNA，但是要注意的是，DNA量過少固然轉(zhuǎn)染效率不高，DNA量過多同樣會降低轉(zhuǎn)染效率。有的初學(xué)者習慣按照說明書123地去操作而不求甚解，你“知其然”是否還“知其所以然”呢？DNA:轉(zhuǎn)染試劑的比例的優(yōu)化是非常重要的，特別是對于陽離子脂質(zhì)體、多胺等帶電荷的轉(zhuǎn)染試劑來說，DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物所帶的凈電荷是由轉(zhuǎn)染試劑和DNA的比例決定的，而轉(zhuǎn)染復(fù)合物是否能更好地結(jié)合到帶負電的細胞膜上，很大程度取決于這個凈電荷。所以預(yù)實驗需要按照說明書的要求，按一定比例混合適量的質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)染試劑。有的轉(zhuǎn)染試劑要求DNA的量多些，有的轉(zhuǎn)染試劑效率高只要很少DNA，比如Effectene只需要常規(guī)五分之一的DNA。所以轉(zhuǎn)染前最好能精確定量質(zhì)粒。另外由于質(zhì)粒本身的因素（比如目的基因產(chǎn)物是否有毒、啟動子強弱等因素），單獨DNA也會對細胞生長有一個基礎(chǔ)的影響，所以同時做幾組不同量的對照實驗進行優(yōu)化是很有幫助的。另外值得注意的是，當細胞鋪板密度較高時，需要的質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)染試劑的量也會略微提高。 轉(zhuǎn)染實驗中要注意的一些問題之三 不同的實驗技術(shù)都是為了滿足不同的實驗需要，RNA轉(zhuǎn)染提供了另一種有別于DNA轉(zhuǎn)染的研究探索手段——直接將體外翻譯的RNA、或者病毒RNA、或RNA oligos，或siRNA、甚至核糖體利用轉(zhuǎn)染技術(shù)帶入細胞中。由于不需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄即可直接翻譯，RNA轉(zhuǎn)染得到的結(jié)果比DNA轉(zhuǎn)染更快更直接，當然僅限于瞬時表達。RNA轉(zhuǎn)染的這些特性很適合某些研究：比如處于非分裂期的細胞轉(zhuǎn)染或者很難用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞，RNA病毒的研究，反義RNA的轉(zhuǎn)染，siRNA轉(zhuǎn)染（RNA干擾）等等。 哪些因素影響RNA轉(zhuǎn)染的效率？ 既然都是核酸，傳統(tǒng)的DNA轉(zhuǎn)染方法都可以用來轉(zhuǎn)染RNA，不過最頭疼的就是RNA容易降解和防止RNAse污染。 RNA操作要注意的事項我們就不用羅嗦了，轉(zhuǎn)染中要額外注意的就是轉(zhuǎn)染試劑應(yīng)該是確認無RNase污染的，而且也盡量避免和質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染混用——即使試劑本身兼容DNA和RNA轉(zhuǎn)染，你也要想到人家做質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染時往往不會這么小心，難免將污染混入，那你豈不是很冤？多數(shù)情況下轉(zhuǎn)染試劑都不建議自己分裝，因為不同的管材可能會影響轉(zhuǎn)染試劑的穩(wěn)定性，那就更得不償失了。所以RNA專用的轉(zhuǎn)染試劑會更好一些。還有重要的一點就是要采用優(yōu)質(zhì)無RNAse污染的血清。 轉(zhuǎn)染時的細胞匯合度常常會比DNA轉(zhuǎn)染高一點，也許是因為RNA轉(zhuǎn)染表達比DNA快？RNA轉(zhuǎn)染的用量必須參考轉(zhuǎn)染試劑說明，因為RNA和轉(zhuǎn)染試劑的比例決定了轉(zhuǎn)染復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和凈電荷，以及是否容易被細胞膜吸附和內(nèi)吞。RNA少了固然表達不好，太多也會有毒性的問題。有的品牌轉(zhuǎn)染試劑有促核酸凝聚的試劑，幫助核酸折疊為較為致密的結(jié)構(gòu)。如果轉(zhuǎn)染試劑對細胞沒有太大影響，轉(zhuǎn)染復(fù)合物和細胞共同孵育的時間越長當然越好。不過，如果RNA本身帶有熒光標記的化，檢測前通常要洗掉多余的RNA以免干擾結(jié)果。 除了操作，RNA本身的結(jié)構(gòu)也對轉(zhuǎn)染有一定的影響。哺乳動物的mRNA分子帶有5'端帽子結(jié)構(gòu)和3'端PolyA尾巴，此外還有成為IRES（internal ribosomal entry site）的核糖體結(jié)合區(qū)，這些結(jié)構(gòu)或者有助于提高mRNA的穩(wěn)定性，或者有助于核糖體結(jié)合到mRNA上進行翻譯。對于體外轉(zhuǎn)錄得到RNA可以通過實驗加入模擬RNA5'端帽子結(jié)構(gòu)類似物而獲得這個保護性的“帽子”（Ambion公司有提供的），3'端PolyA尾巴也可以通過實驗添加。多數(shù)情況下添加這些元件有助于提高RNA進入細胞后的穩(wěn)定性。但是有時候IRES元件促進翻譯的進行，而到有的細胞株中，由于缺乏相應(yīng)的結(jié)合蛋白，IRES反而影響轉(zhuǎn)錄。這個在RNA轉(zhuǎn)染實驗設(shè)計中是要格外注意的。RNA干擾實驗中的siRNA結(jié)構(gòu)對基因沉默效果也有影響，比如推薦添加的AA(N19)TT結(jié)構(gòu)（AA(N21)或者CA(N21)也是可以的）。這就不在轉(zhuǎn)染的討論范圍內(nèi)了。 Oligo轉(zhuǎn)染 反義寡核苷酸一度曾經(jīng)是制藥領(lǐng)域的希望之光。Oligo的轉(zhuǎn)染還是屬于DNA轉(zhuǎn)染，由于分子小，轉(zhuǎn)染的主要問題是轉(zhuǎn)染后的穩(wěn)定性。2'-O-methyl oligoribonucleotides比一般的Oligo穩(wěn)定，硫代S-Oligo可以抗拒核酸酶的降解但不可以磷酸化，如何選擇就要根據(jù)實驗?zāi)康亩恕?br /> 我們終于結(jié)束了轉(zhuǎn)染這一部分。希望對你有所幫助。最后我們再順帶介紹通常在轉(zhuǎn)染時遇到問題該如何面對——畢竟不同的細胞和不同的實驗?zāi)康�，遇到困難往往是難于預(yù)料的，所以無論前人是否已經(jīng)為你提供了現(xiàn)成的方法，如果是除初次嘗試某種試劑或者某種細胞系，這幾個對照是一定要做的：空白對照，只加一定量核酸的對照，只加一定量轉(zhuǎn)染試劑的對照，2個以上不同的量比實驗，對于檢查問題是非常有用的。 轉(zhuǎn)染效率低：可能的原因： 轉(zhuǎn)染試劑不適合（比如空白對照的細胞存活率就低等等） 轉(zhuǎn)染試劑和核酸或者蛋白的量不夠，或者比例不對（自行調(diào)整咯，別告訴我你不會） 基因表達時間（檢測時間）有問題（孵育更長時間吧，如果沒有毒性問題的化，如果毒性也隨轉(zhuǎn)染效率提高，那就要縮小孵育時間拉） 副作用（比如目的基因的毒性）（換誘導(dǎo)型啟動子吧） 核酸或者蛋白質(zhì)量問題（重做純化實驗） 報告基因或者檢測系統(tǒng)的問題 細胞死亡率高： 過量的轉(zhuǎn)染試劑或者轉(zhuǎn)染復(fù)合物（減少用量或者減少孵育時間，轉(zhuǎn)染后洗細胞） 細胞問題（重新復(fù)蘇活化一個細胞株，或者重新傳代） 目的基因毒性（減少用量） 轉(zhuǎn)染效率重復(fù)性差： 細胞匯合度不同（保證同樣的接種量同樣的時間） 支原體污染（殺了它吧，重新復(fù)蘇一管新的） 細胞傳代次數(shù)太高了（重新復(fù)蘇一管新的細胞） 血清質(zhì)量不穩(wěn)定（一次囤積同一批號的血清） |
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xiaomili1206
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2樓2015-08-21 14:53:22
xiaomili1206
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