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轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)要注意的一些問題
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轉(zhuǎn)自 尚尚的博客 http://blog.sina.com.cn/shanghuiqing 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)要注意的一些問題之一 轉(zhuǎn)染——讓克隆的核酸進(jìn)入真核細(xì)胞中，已經(jīng)成為研究和控制真核細(xì)胞基因表達(dá)的重要手段。比如表達(dá)純化特定的蛋白；鑒定一個(gè)基因的生物學(xué)特性；突變分析；研究基因表達(dá)對細(xì)胞生長的影響，研究基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制等等，等等。如今廣義的轉(zhuǎn)染不單包括了DNA、RNA，還有蛋白質(zhì)等生物大分子。 很多因素會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞株本身啦，細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境啦，轉(zhuǎn)染的DNA、RNA或者蛋白的質(zhì)量和特性啦，轉(zhuǎn)染方法啦，等等。每個(gè)轉(zhuǎn)染高手也必然有自己的獨(dú)門心經(jīng)，只可惜大家都為實(shí)驗(yàn)或者生活而疲于奔命，沒有幾個(gè)人愿意靜下心情來仔細(xì)總結(jié)經(jīng)驗(yàn)匯集成文字——那些曾經(jīng)用無數(shù)失敗的痛苦煩惱換回來的寶貴經(jīng)驗(yàn)，那些曾經(jīng)以為會(huì)永遠(yuǎn)銘刻于腦海的教訓(xùn)，隨時(shí)間的流逝而終于漸漸褪色，到模糊。即使偶爾有珠玉掩埋于浩瀚的口水中，也難以匯串成珠。試劑盒的盛行，讓實(shí)驗(yàn)更快，更簡單，也更機(jī)械化，相信更多人更愿意先抓起Protocol 123地往下做，直到碰壁再苦思原因。其實(shí)等碰得遍體鱗傷回頭一看就會(huì)醒悟，很多坑，只要事前注意了就不會(huì)陷進(jìn)去的。 DNA轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)可以在1－4天內(nèi)檢測到——僅有一部分轉(zhuǎn)入細(xì)胞的DNA被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并最終輸出mRNA到細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行蛋白合成。幾天內(nèi)，大部分外源DNA會(huì)被核酸酶降解或隨細(xì)胞分裂而稀釋；一周后就檢測不到其存在了。因此轉(zhuǎn)染也可以分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染（transient transfection）指的是轉(zhuǎn)染的核酸不整合到染色體上，結(jié)果是短暫的高水平表達(dá)，可在24—96小時(shí)內(nèi)檢測表達(dá)效果，表達(dá)水平與位置無關(guān)，不會(huì)受到周圍染色體元件的影響。瞬時(shí)表達(dá)分析所需的人力和時(shí)間比穩(wěn)定表達(dá)少，但因?yàn)镈NA攝入效率和表達(dá)水平在不同實(shí)驗(yàn)中差異較大，不長久也不穩(wěn)定。超螺旋質(zhì)粒轉(zhuǎn)染更傾向于瞬時(shí)表達(dá)。瞬時(shí)表達(dá)適合研究啟動(dòng)子等調(diào)控元件——不過，誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子除外。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，就是轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA整合到染色體上，或者相當(dāng)于附加子（episome）可持續(xù)存在，使得轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可長期表達(dá)。外源基因整合的幾率很小，要獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，通常需要有篩選標(biāo)記（比如抗性基因）共同轉(zhuǎn)染，通過選擇壓力維持表達(dá)的穩(wěn)定——不行的統(tǒng)統(tǒng)槍斃了。質(zhì)粒整合到染色體上本來就是件稀罕事兒，平均萬分之一的幾率，如果是線性化DNA轉(zhuǎn)染，那整合的幾率就高多了。不過怎么整合也就是一個(gè)或者有限的幾個(gè)拷貝，所以表達(dá)量往往比較不高的。但是，“壓倒一切的是'穩(wěn)定'”，很多時(shí)候，轉(zhuǎn)染后往往要進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)的篩選。 成功轉(zhuǎn)染第一步：細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng) 細(xì)胞系的選擇通常不是我們說了算的。有時(shí)是實(shí)驗(yàn)的需要，有時(shí)是實(shí)驗(yàn)室條件的限制。如果有選擇的余地當(dāng)然挑個(gè)容易做的。越是接近體內(nèi)的真實(shí)情況的原代細(xì)胞，通常越是難于伺候。反之亦然。此外細(xì)胞本身的特性也是需要考慮的因素。有時(shí)需要根據(jù)細(xì)胞系來選擇合適的轉(zhuǎn)染方法；而有時(shí)一些啟動(dòng)子在不同的細(xì)胞系中表現(xiàn)的功能也不同。這些都是設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)需要考慮的因素，姑且不論。不過因?yàn)槭芟抻谔囟ǖ募?xì)胞，如何選擇合適的轉(zhuǎn)染方法就值得考究了。因?yàn)椴煌募?xì)胞可能適用不同的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染條件。如果實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立了全套方法，照做可也。如果是個(gè)新來的細(xì)胞株，最好查查資料看哪些成功轉(zhuǎn)染案例。每種轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株列表和文獻(xiàn)，看看其中是否有你的新對手——這個(gè)FuGENE 6 比較有優(yōu)勢，已有750多種細(xì)胞系成功轉(zhuǎn)染的資料可供參考。 當(dāng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到轉(zhuǎn)染這一步時(shí)需要注意的因素有哪些呢？ 一、健康而茁壯成長的細(xì)胞 轉(zhuǎn)染前細(xì)胞最好經(jīng)過1—2次傳代，以保證細(xì)胞生長旺盛，容易轉(zhuǎn)染。注意，貼壁細(xì)胞生長到幾乎匯片時(shí)就要趕快進(jìn)行下一次傳代，千萬不要使細(xì)胞保持融合超過24小時(shí)，因?yàn)橐坏╅L滿了，細(xì)胞們就“故步自封”不思轉(zhuǎn)染啦�；盍Τ渑娴哪贻p細(xì)胞更容易接受外來的新鮮事物嘛。 大多數(shù)已建立的細(xì)胞系都是非整倍體，細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化，這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。如果隨時(shí)間發(fā)現(xiàn)這種變化，融化一管新鮮的細(xì)胞可能會(huì)恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。比如，新鮮融化的NIH 3T3細(xì)胞比傳代8次的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率（融化細(xì)胞的進(jìn)一步傳代不會(huì)馬上降低轉(zhuǎn)染效率）。因此，如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)最佳結(jié)果。 二、恰到好處的鋪板密度 轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度對轉(zhuǎn)染效率影響非常顯著。不同的轉(zhuǎn)染試劑，要求轉(zhuǎn)染時(shí)的最適細(xì)胞密度各不相同，即使同一種試劑，也會(huì)因不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。轉(zhuǎn)染時(shí)過高或者過低的細(xì)胞密度會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低，乃至表達(dá)水平偏低。因此如果選用新的細(xì)胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑，最好能夠進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)并為以后的實(shí)驗(yàn)建立一個(gè)穩(wěn)定方法，包括適當(dāng)?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時(shí)間等等。一般轉(zhuǎn)染時(shí)貼壁細(xì)胞密度為40%-80%，但這個(gè)需要參考所選轉(zhuǎn)染試劑的說明書——陽離子脂質(zhì)體具有微量的細(xì)胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細(xì)胞數(shù)，有的要求細(xì)胞90%匯片；而有些多胺或者非脂質(zhì)體的配方則要求在40%—80%之間，總之是盡量在細(xì)胞最適的生理狀態(tài)下轉(zhuǎn)染，以求最佳的轉(zhuǎn)染效果。 不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊矔?huì)影響轉(zhuǎn)染時(shí)的鋪板密度，比如研究細(xì)胞周期相關(guān)基因等表達(dá)周期長的基因，就需要較低的鋪板密度，所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進(jìn)行轉(zhuǎn)染的試劑。需要特別注意。 三、溫暖舒適的培養(yǎng)基 健康的細(xì)胞培養(yǎng)是一切成功轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)。不同的細(xì)胞類型有不同的特性，需要特定的培養(yǎng)基、血清、補(bǔ)充添加劑等等。 血清 血清一度曾被認(rèn)為會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率，老一代的轉(zhuǎn)染方法往往要求轉(zhuǎn)染前后洗細(xì)胞或者在無血清培養(yǎng)基條件下轉(zhuǎn)染，對于某些對血清要求敏感的細(xì)胞來說是個(gè)難題。不過轉(zhuǎn)染產(chǎn)品配方幾經(jīng)革新后的今天，對于主流的轉(zhuǎn)染試劑來說，血清的存在已經(jīng)不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率，比如FuGENE6、Effectene和GeneJuice等。對于多數(shù)可以在有血清條件下工作的轉(zhuǎn)染試劑來說，血清的存在會(huì)影響DNA—轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成，但只要在DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成時(shí)用無血清培養(yǎng)基來稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑就可以了，在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。這些方便好用、可在有血清條件下轉(zhuǎn)染的試劑包括前面介紹的Lipofectamine2000，F(xiàn)uGENE 6，GeneJuice，Effectene，Polyfect等等。最厲害的是Qiagen的2個(gè)產(chǎn)品，Polyfect和Effectene，全程都可以用有血清和抗生素等添加劑的完全培養(yǎng)基來操作，包括稀釋步驟，不用擔(dān)心培養(yǎng)基的變化對細(xì)胞生長有什么不良影響了。這樣，就不再需要在轉(zhuǎn)染前多次洗細(xì)胞，也就減少操作的復(fù)雜程度，更重要的是不必再讓細(xì)胞處于無血清的“悲慘環(huán)境”中轉(zhuǎn)染，不必?fù)?dān)心對血清缺乏很敏感的細(xì)胞受到不必要的麻煩了。嬌貴的細(xì)胞們，你們有福了。不過要特別注意：對于RNA轉(zhuǎn)染，如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關(guān)注的。所以血清的質(zhì)量也是需要關(guān)注的。新加培養(yǎng)基的預(yù)熱對細(xì)胞轉(zhuǎn)染很有幫助。 抗生素 支原體、細(xì)菌、真菌污染，無論對于細(xì)胞培養(yǎng)或者轉(zhuǎn)染都是“不堪回首的痛”，可能會(huì)嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)染結(jié)果，細(xì)胞培養(yǎng)過程中往往會(huì)添加抗生素來防止污染。但是這些添加劑可能對轉(zhuǎn)染造成麻煩。比如青霉素和鏈霉素，就是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細(xì)胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這可能間接導(dǎo)致細(xì)胞死亡，造成轉(zhuǎn)染效率低。所以，對于選擇Lipofectamine2000系列轉(zhuǎn)染試劑的實(shí)驗(yàn)，要特別注意在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素，甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時(shí)也要避免使用抗生素。這樣，在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細(xì)胞。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因?yàn)檫@些抗生素是GENETICIN選擇性抗生素的競爭性抑制劑。另外，為了保證無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長，使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。這里又要表揚(yáng)Qiagen的2個(gè)產(chǎn)品，Polyfect和Effectene，因?yàn)槿潭伎梢杂糜醒搴涂股氐忍砑觿┑耐耆囵B(yǎng)基來操作，很方便的。對于篩選穩(wěn)定表達(dá)株，要預(yù)留足夠的時(shí)間讓抗性基因表達(dá)后再添加篩選壓力。 其他添加物如抗生素，EDTA，檸檬酸鹽，磷酸鹽，RPMI，硫酸軟骨素，透明質(zhì)酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖這些物質(zhì)的存在可能會(huì)干擾DNA和轉(zhuǎn)染試劑形成復(fù)合物的過程，要盡量避免。 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)要注意的一些問題之二 一、質(zhì)粒的構(gòu)建：啟動(dòng)子的選擇 啟動(dòng)子的選擇對于轉(zhuǎn)染基因的有效表達(dá)是非常重要的。對于轉(zhuǎn)染過程本身雖然無甚影響，但是對轉(zhuǎn)染結(jié)果卻有著微妙的影響。 啟動(dòng)子可分為2大類：誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是比較精明的，平時(shí)歇著，一旦接到誘導(dǎo)信號(hào)指示就馬上開工干活兒。而組成型啟動(dòng)子比較老實(shí)的，就是從頭到尾不停干活從不閑著的那種——比如我們很熟悉的CMV啟動(dòng)子啊，SV40啊，pMC1啊，PGK啟動(dòng)子啊等等。 獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動(dòng)子依賴于選用的細(xì)胞系和要表達(dá)的蛋白。CMV啟動(dòng)子在大多數(shù)細(xì)胞類型中可以獲得高表達(dá)活性。在BHK-21中，CMV啟動(dòng)子活性比其他啟動(dòng)子如SV40和RSV都要高。但這三種病毒啟動(dòng)子在T細(xì)胞來源的細(xì)胞系，如Jurkat中組成表達(dá)水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat細(xì)胞中CMV啟動(dòng)子，而單PMA就足以激活KG1和K562（人骨髓瘤白細(xì)胞）中的CMV啟動(dòng)子。SV40啟動(dòng)子的表達(dá)在含有大T抗原（存在于COS-1和COS-7）時(shí)會(huì)提高，因?yàn)榇骉抗原可以刺激染色體外的合成。 一個(gè)強(qiáng)悍的高表達(dá)組成型啟動(dòng)子是我們做表達(dá)所求之不得的，但是對于轉(zhuǎn)染本身來說卻不一定好——因?yàn)槿魏纬掷m(xù)過高表達(dá)外源基因都可能帶來某種程度的細(xì)胞毒性，影響細(xì)胞生長——如果外源基因本身對細(xì)胞生長有毒，那更完蛋了，你很可能篩不到轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞株，更別提穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了——因?yàn)檫^量表達(dá)本身可能已經(jīng)害死了那個(gè)轉(zhuǎn)染了的細(xì)胞，沒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞又死于篩選壓力。這種時(shí)候一個(gè)不那么“能干”的啟動(dòng)子可能更適合一些。如果你曾經(jīng)遇到原因不明的轉(zhuǎn)染失敗案例，會(huì)不會(huì)是這個(gè)原因呢？過猶不及就是這個(gè)道理咯。 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子對于轉(zhuǎn)染來說，特別是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，可能是更好的選擇。它使得目的基因的表達(dá)可以受到我們的調(diào)控——轉(zhuǎn)染的時(shí)候不表達(dá)，篩選穩(wěn)定表達(dá)株后再誘導(dǎo)表達(dá)，使得表達(dá)有毒性的基因或者精確分析表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)效應(yīng)成為可能。多數(shù)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在接受某種信號(hào)后“打開開關(guān)”開始工作，也有的相反，在缺失某種信號(hào)后打開開關(guān)。Clontech還有個(gè)誘導(dǎo)系統(tǒng)是“劑量依賴的”，就是說不單表達(dá)開關(guān)可控，表達(dá)量多少也可以通過誘導(dǎo)劑的量來調(diào)控。還有一種特殊的啟動(dòng)子很好玩——具有時(shí)序性或者組織特異性（空間特異性），會(huì)受到特定的元件調(diào)控，在一定的時(shí)間或者特定組織細(xì)胞中表達(dá)的，比如那個(gè)轉(zhuǎn)基因山羊奶里用的只在泌乳期的乳腺細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子——有人說這是組成型的，我覺得應(yīng)該是誘導(dǎo)型的，只不過誘導(dǎo)的因素我們不知道罷了，這類啟動(dòng)子在不同的細(xì)胞中會(huì)有不同的表現(xiàn)，需要注意。誘導(dǎo)系統(tǒng)的問題主要是本底表達(dá)，表達(dá)量有限，以及誘導(dǎo)劑本身對細(xì)胞的影響和如何清除。 轉(zhuǎn)染DNA的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子如果不被宿主細(xì)胞識(shí)別也會(huì)產(chǎn)生無法表達(dá)的“悲劇”，這是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)需要注意的問題。不過現(xiàn)在利用現(xiàn)成試劑盒或者模擬國外已經(jīng)成功的實(shí)驗(yàn)的居多，獨(dú)立構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)的極少，因而這種問題遇到的幾率也幾乎可以忽略不計(jì)。 目的基因：這個(gè)對于研究人員來說是目的，因而沒有選擇的余地。如果你的目的基因正好會(huì)影響選定細(xì)胞株的生長，甚至有毒，那最好選擇一個(gè)誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子，不然你可能總是轉(zhuǎn)染不了。但是通常在實(shí)驗(yàn)之前我們不清楚我們研究的基因產(chǎn)物是否對選定的細(xì)胞有毒，所以正負(fù)對照很重要。當(dāng)排除其他原因后轉(zhuǎn)染總是失敗，應(yīng)當(dāng)從根本上考慮原因。 二、質(zhì)粒的大小和質(zhì)量 線性化還是超螺旋會(huì)影響轉(zhuǎn)染結(jié)果：超螺旋質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率比線性DNA高得多，特別是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。而線性化DNA轉(zhuǎn)染的整合幾率高。質(zhì)粒太大了轉(zhuǎn)染會(huì)困難一些。畢竟，相對致密、較小的外源異物被細(xì)胞內(nèi)吞的幾率要大一些。如果你的質(zhì)粒正好比較大，又沒有經(jīng)驗(yàn)，選擇特別注明可以轉(zhuǎn)大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染試劑成功幾率會(huì)高一些。有的轉(zhuǎn)染試劑還會(huì)提供一些促進(jìn)DNA凝聚的成分，使得DNA形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物時(shí)更致密一些，更容易轉(zhuǎn)染一些。 純化質(zhì)粒的質(zhì)量無疑會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。哺乳動(dòng)物細(xì)胞總歸是比大腸桿菌嬌氣，轉(zhuǎn)染難度高些，因而要求的DNA純度要更高些。早年要做轉(zhuǎn)染真是大陣仗啊，光是提質(zhì)粒做超離就令人皺眉。最令人頭疼的是內(nèi)毒素了。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上特有的成分，主要是脂多糖中的類脂A（lipopolysaccharides），在細(xì)菌被裂解時(shí)被釋放出來，由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)和特性，在質(zhì)粒提取的過程中內(nèi)毒素很容易混入質(zhì)粒DNA中共同純化出來。內(nèi)毒素的存在會(huì)嚴(yán)重地影響轉(zhuǎn)染效率，此外內(nèi)毒素可能會(huì)激活造血細(xì)胞（例如B細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞等）的非特異免疫反應(yīng)，造成實(shí)驗(yàn)中的假陽性。所以質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)盡量采用無內(nèi)毒素污染的超純質(zhì)粒。幸好技術(shù)的進(jìn)步令復(fù)雜的操作成為過去，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室會(huì)選擇使用轉(zhuǎn)染級(jí)別的質(zhì)粒純化試劑盒純化的質(zhì)粒來轉(zhuǎn)染。對于一些“耐受性高、容易操作的”細(xì)胞株，普通的Kit已經(jīng)夠了。對于一些對內(nèi)毒素特別敏感的細(xì)胞，就要用“去內(nèi)毒素”的質(zhì)粒純化Kit了。Qiagen的Endofree系列可以得到相當(dāng)于2次CsCl超速離心純度的質(zhì)粒，同時(shí)特別設(shè)計(jì)去除內(nèi)毒素，專為最嬌氣的細(xì)胞系轉(zhuǎn)染和體內(nèi)DNA疫苗而設(shè)計(jì)。此外現(xiàn)在Invitrogen和Stratagene都有一些快速純化質(zhì)粒同時(shí)也去內(nèi)毒素的Kit，使得去除質(zhì)粒中的內(nèi)毒素更為簡便。 質(zhì)粒DNA的濃度和量：既然質(zhì)粒純化已經(jīng)不成問題，初學(xué)者通常都不會(huì)在乎甚至愿意多加點(diǎn)DNA，但是要注意的是，DNA量過少固然轉(zhuǎn)染效率不高，DNA量過多同樣會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率。有的初學(xué)者習(xí)慣按照說明書123地去操作而不求甚解，你“知其然”是否還“知其所以然”呢？DNA:轉(zhuǎn)染試劑的比例的優(yōu)化是非常重要的，特別是對于陽離子脂質(zhì)體、多胺等帶電荷的轉(zhuǎn)染試劑來說，DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物所帶的凈電荷是由轉(zhuǎn)染試劑和DNA的比例決定的，而轉(zhuǎn)染復(fù)合物是否能更好地結(jié)合到帶負(fù)電的細(xì)胞膜上，很大程度取決于這個(gè)凈電荷。所以預(yù)實(shí)驗(yàn)需要按照說明書的要求，按一定比例混合適量的質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)染試劑。有的轉(zhuǎn)染試劑要求DNA的量多些，有的轉(zhuǎn)染試劑效率高只要很少DNA，比如Effectene只需要常規(guī)五分之一的DNA。所以轉(zhuǎn)染前最好能精確定量質(zhì)粒。另外由于質(zhì)粒本身的因素（比如目的基因產(chǎn)物是否有毒、啟動(dòng)子強(qiáng)弱等因素），單獨(dú)DNA也會(huì)對細(xì)胞生長有一個(gè)基礎(chǔ)的影響，所以同時(shí)做幾組不同量的對照實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化是很有幫助的。另外值得注意的是，當(dāng)細(xì)胞鋪板密度較高時(shí)，需要的質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)染試劑的量也會(huì)略微提高。 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中要注意的一些問題之三 不同的實(shí)驗(yàn)技術(shù)都是為了滿足不同的實(shí)驗(yàn)需要，RNA轉(zhuǎn)染提供了另一種有別于DNA轉(zhuǎn)染的研究探索手段——直接將體外翻譯的RNA、或者病毒RNA、或RNA oligos，或siRNA、甚至核糖體利用轉(zhuǎn)染技術(shù)帶入細(xì)胞中。由于不需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄即可直接翻譯，RNA轉(zhuǎn)染得到的結(jié)果比DNA轉(zhuǎn)染更快更直接，當(dāng)然僅限于瞬時(shí)表達(dá)。RNA轉(zhuǎn)染的這些特性很適合某些研究：比如處于非分裂期的細(xì)胞轉(zhuǎn)染或者很難用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，RNA病毒的研究，反義RNA的轉(zhuǎn)染，siRNA轉(zhuǎn)染（RNA干擾）等等。 哪些因素影響RNA轉(zhuǎn)染的效率？ 既然都是核酸，傳統(tǒng)的DNA轉(zhuǎn)染方法都可以用來轉(zhuǎn)染RNA，不過最頭疼的就是RNA容易降解和防止RNAse污染。 RNA操作要注意的事項(xiàng)我們就不用羅嗦了，轉(zhuǎn)染中要額外注意的就是轉(zhuǎn)染試劑應(yīng)該是確認(rèn)無RNase污染的，而且也盡量避免和質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染混用——即使試劑本身兼容DNA和RNA轉(zhuǎn)染，你也要想到人家做質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染時(shí)往往不會(huì)這么小心，難免將污染混入，那你豈不是很冤？多數(shù)情況下轉(zhuǎn)染試劑都不建議自己分裝，因?yàn)椴煌墓懿目赡軙?huì)影響轉(zhuǎn)染試劑的穩(wěn)定性，那就更得不償失了。所以RNA專用的轉(zhuǎn)染試劑會(huì)更好一些。還有重要的一點(diǎn)就是要采用優(yōu)質(zhì)無RNAse污染的血清。 轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞匯合度常常會(huì)比DNA轉(zhuǎn)染高一點(diǎn)，也許是因?yàn)镽NA轉(zhuǎn)染表達(dá)比DNA快？RNA轉(zhuǎn)染的用量必須參考轉(zhuǎn)染試劑說明，因?yàn)镽NA和轉(zhuǎn)染試劑的比例決定了轉(zhuǎn)染復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和凈電荷，以及是否容易被細(xì)胞膜吸附和內(nèi)吞。RNA少了固然表達(dá)不好，太多也會(huì)有毒性的問題。有的品牌轉(zhuǎn)染試劑有促核酸凝聚的試劑，幫助核酸折疊為較為致密的結(jié)構(gòu)。如果轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞沒有太大影響，轉(zhuǎn)染復(fù)合物和細(xì)胞共同孵育的時(shí)間越長當(dāng)然越好。不過，如果RNA本身帶有熒光標(biāo)記的化，檢測前通常要洗掉多余的RNA以免干擾結(jié)果。 除了操作，RNA本身的結(jié)構(gòu)也對轉(zhuǎn)染有一定的影響。哺乳動(dòng)物的mRNA分子帶有5'端帽子結(jié)構(gòu)和3'端PolyA尾巴，此外還有成為IRES（internal ribosomal entry site）的核糖體結(jié)合區(qū)，這些結(jié)構(gòu)或者有助于提高mRNA的穩(wěn)定性，或者有助于核糖體結(jié)合到mRNA上進(jìn)行翻譯。對于體外轉(zhuǎn)錄得到RNA可以通過實(shí)驗(yàn)加入模擬RNA5'端帽子結(jié)構(gòu)類似物而獲得這個(gè)保護(hù)性的“帽子”（Ambion公司有提供的），3'端PolyA尾巴也可以通過實(shí)驗(yàn)添加。多數(shù)情況下添加這些元件有助于提高RNA進(jìn)入細(xì)胞后的穩(wěn)定性。但是有時(shí)候IRES元件促進(jìn)翻譯的進(jìn)行，而到有的細(xì)胞株中，由于缺乏相應(yīng)的結(jié)合蛋白，IRES反而影響轉(zhuǎn)錄。這個(gè)在RNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中是要格外注意的。RNA干擾實(shí)驗(yàn)中的siRNA結(jié)構(gòu)對基因沉默效果也有影響，比如推薦添加的AA(N19)TT結(jié)構(gòu)（AA(N21)或者CA(N21)也是可以的）。這就不在轉(zhuǎn)染的討論范圍內(nèi)了。 Oligo轉(zhuǎn)染 反義寡核苷酸一度曾經(jīng)是制藥領(lǐng)域的希望之光。Oligo的轉(zhuǎn)染還是屬于DNA轉(zhuǎn)染，由于分子小，轉(zhuǎn)染的主要問題是轉(zhuǎn)染后的穩(wěn)定性。2'-O-methyl oligoribonucleotides比一般的Oligo穩(wěn)定，硫代S-Oligo可以抗拒核酸酶的降解但不可以磷酸化，如何選擇就要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩恕?br /> 我們終于結(jié)束了轉(zhuǎn)染這一部分。希望對你有所幫助。最后我們再順帶介紹通常在轉(zhuǎn)染時(shí)遇到問題該如何面對——畢竟不同的細(xì)胞和不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模龅嚼щy往往是難于預(yù)料的，所以無論前人是否已經(jīng)為你提供了現(xiàn)成的方法，如果是除初次嘗試某種試劑或者某種細(xì)胞系，這幾個(gè)對照是一定要做的：空白對照，只加一定量核酸的對照，只加一定量轉(zhuǎn)染試劑的對照，2個(gè)以上不同的量比實(shí)驗(yàn)，對于檢查問題是非常有用的。 轉(zhuǎn)染效率低：可能的原因： 轉(zhuǎn)染試劑不適合（比如空白對照的細(xì)胞存活率就低等等） 轉(zhuǎn)染試劑和核酸或者蛋白的量不夠，或者比例不對（自行調(diào)整咯，別告訴我你不會(huì)） 基因表達(dá)時(shí)間（檢測時(shí)間）有問題（孵育更長時(shí)間吧，如果沒有毒性問題的化，如果毒性也隨轉(zhuǎn)染效率提高，那就要縮小孵育時(shí)間拉） 副作用（比如目的基因的毒性）（換誘導(dǎo)型啟動(dòng)子吧） 核酸或者蛋白質(zhì)量問題（重做純化實(shí)驗(yàn)） 報(bào)告基因或者檢測系統(tǒng)的問題 細(xì)胞死亡率高： 過量的轉(zhuǎn)染試劑或者轉(zhuǎn)染復(fù)合物（減少用量或者減少孵育時(shí)間，轉(zhuǎn)染后洗細(xì)胞） 細(xì)胞問題（重新復(fù)蘇活化一個(gè)細(xì)胞株，或者重新傳代） 目的基因毒性（減少用量） 轉(zhuǎn)染效率重復(fù)性差： 細(xì)胞匯合度不同（保證同樣的接種量同樣的時(shí)間） 支原體污染（殺了它吧，重新復(fù)蘇一管新的） 細(xì)胞傳代次數(shù)太高了（重新復(fù)蘇一管新的細(xì)胞） 血清質(zhì)量不穩(wěn)定（一次囤積同一批號(hào)的血清） |
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