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zeroon木蟲 (正式寫手)
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[求助]
做亞細(xì)胞定位，主要是定位液泡，請問融合蛋白表達(dá)載體應(yīng)該如何構(gòu)建呢 已有2人參與
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看到文獻(xiàn)中，液泡中的的蛋白酶——羧肽酶，常作為marker蛋白定位，既給這個(gè)蛋白融合一段gfp，然后在細(xì)胞內(nèi)即可定位液泡的位置。 但是找了好多文獻(xiàn)，都沒具體寫清楚分子構(gòu)建那地方是怎么樣的。 我應(yīng)該在羧肽酶基因的后面直接跟著加上gfp序列呢，還是中間隔開幾個(gè)序列再加？看到這篇文獻(xiàn)Visualization of vacuoles in Aspergillus oryzae by expression of CPY–EGFP。 里面提到First,the CPY–EGFP expression plasmid was constructed to constitutively express CPY–EGFP fusion protein,which contains six amino acids between CPY and EGFP,under A. oryzae pgkA promoter,which is a constitutively expressing strong promoter of 3-phosphoglycerate kinase gene。 我覺得好奇怪啊，為什么在CPY和EGFP之間加入6個(gè)氨基酸呢？而且這篇文章通篇也沒寫清楚到底這6個(gè)氨基酸是什么？ 求做過相關(guān)研究的大神給與指導(dǎo)，不慎感激。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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zeroon: 金幣+5, ★有幫助, 額，謝謝，可能懂了一些 2015-08-22 22:00:49
zeroon: 金幣+5, ★有幫助, 額，謝謝，可能懂了一些 2015-08-22 22:00:49
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融合蛋白就是把你基因和GFP表達(dá)后融合在一起。我們這么亞細(xì)胞定位常做，很容易。 說白了就是有一個(gè)原核表達(dá)的空載，確定空載的GFP在多克隆位點(diǎn)的前邊還是后邊，如果GFP在多克隆位點(diǎn)的前邊，那么在多克隆位點(diǎn)直接插入你目標(biāo)基因（此處是你液泡羧肽酶基因，注意不要堿基移碼）；如果GFP基因是在多克隆位點(diǎn)后邊，那么把你目標(biāo)基因去掉終止密碼子插入多克隆位點(diǎn)（同上，注意插入位點(diǎn)到GFP起始密碼子ATG，此段不要堿基移碼），然后轉(zhuǎn)染擬南芥染色質(zhì)體或者基因槍洋蔥表皮，就可以在共聚焦顯微鏡下觀察了。 說了這么多，不知道你懂了沒有。 |
7樓2015-08-22 19:03:11
ptttmt
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2樓2015-08-19 01:24:47
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3樓2015-08-19 01:27:35
zeroon
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8樓2015-08-22 22:02:59
9樓2015-08-22 22:23:42
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10樓2019-04-25 15:18:59
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