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siRNA轉染常見問題及解決方案 已有4人參與
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1. RNA與轉染試劑比例不佳 由于RNA序列差異、合成條件不同以及是否帶有熒光等標記，決定了RNA和轉染試劑在不同情況下會有不同的最佳條件，建議先進行預實驗優(yōu)化。 2. 細胞密度不佳 調整細胞密度到轉染時匯合度為20-40%。成功轉染siRNA的細胞會產(chǎn)生目標基因表達下調，但未成功轉染的細胞卻不受影響，這時轉染效率和總的細胞數(shù)量就很重要，一般細胞數(shù)量較少時轉染效率高。由于siRNA沉默時效性的影響，轉染后48小時才能進行進行qRT-PCR檢測，轉染后48-72小時才能進行蛋白檢測。如果轉染時鋪板密度較高，細胞一方面轉染效果不理想，直接影響沉默效果和數(shù)據(jù)可靠性，另一方面，48小時甚至更長時間后，沉默檢測最佳點時，過于密集的細胞將影響細胞狀態(tài)，從而影響實驗結果。 3. RNA效率不高 選擇最優(yōu)RNA，并采用已知高效的RNA做對照。siRNA的合成需要注意的是一定要選用高純度的siRNA，siRNA的純度直接關系到轉染效率和沉默效率。siRNA的工.。。。。。 原文詳見：http://www.engreen.cn/ |
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2樓2015-08-21 17:19:46
3樓2015-09-08 10:38:18
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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siRNA轉染常見問題及解決方案 1. RNA與轉染試劑比例不佳 由于RNA序列差異、合成條件不同以及是否帶有熒光等標記，決定了RNA和轉染試劑在不同情況下會有不同的最佳條件，建議先進行預實驗優(yōu)化。 RNA濃度和轉染試劑量的優(yōu)化(24well) 1 2 3 4 RNA工作濃度 25nM 50nM 100nM 150nM 每孔RNA的量(pmol) 0.17μg (12.5pmol) 0.33μg (25pmol) 0.67μg (50pmol) 1μg (75pmol) 每孔轉染試劑量 0.25μl 0.5μl 1μl 1.5μl 2. 細胞密度不佳 調整細胞密度到轉染時匯合度為20-40%。成功轉染siRNA的細胞會產(chǎn)生目標基因表達下調，但未成功轉染的細胞卻不受影響，這時轉染效率和總的細胞數(shù)量就很重要，一般細胞數(shù)量較少時轉染效率高。由于siRNA沉默時效性的影響，轉染后48小時才能進行進行qRT-PCR檢測，轉染后48-72小時才能進行蛋白檢測。如果轉染時鋪板密度較高，細胞一方面轉染效果不理想，直接影響沉默效果和數(shù)據(jù)可靠性，另一方面，48小時甚至更長時間后，沉默檢測最佳點時，過于密集的細胞將影響細胞狀態(tài)，從而影響實驗結果。 3. RNA效率不高 選擇最優(yōu)RNA，并采用已知高效的RNA做對照。siRNA的合成需要注意的是一定要選用高純度的siRNA，siRNA的純度直接關系到轉染效率和沉默效率。siRNA的工作濃度和siRNA的設計、細胞種類、目標基因有關。建議一定進行相關的預實驗優(yōu)化各條件。 4. RNA酶污染 建議無RNA酶和內毒素的吸頭、離心管和溶液等材料和實驗器具。 5. 轉染后培養(yǎng)時間不夠 在mRNA水平可以到48小時以后驗證結果，在蛋白水平可以到72小時后驗證結果。siRNA的沉默效果是有時效性的，在最佳的時間點觀察，會得到更加明顯的沉默效果，這個時間點的確定不能以同一株細胞轉染DNA的經(jīng)驗確定，因為一個是消耗mRNA，一個是產(chǎn)生mRNA。對轉染siRNA，在核酸水平，轉染后8-48小時，即可觀察到mRNA水平的逐步下降，一般來說，轉染后48小時進行qRT-PCR檢測通常會得到漂亮的結果。 6. 培養(yǎng)基毒性 采用含10-20%血清的全培養(yǎng)基。使用脂質體等轉染試劑時，由于含血清轉染會將血清中的蛋白帶入細胞，引發(fā)細胞毒性，導致轉染效率降低，故不能有血清轉染。EntransterTM只濃縮包裹核酸不會將血清帶入細胞，所以可以有血清轉染，同時由于血清的存在，有利于細胞的狀態(tài)維護，故能提高轉染效率。 7. 細胞污染 建議徹底清潔所有細胞培養(yǎng)相關用品 原文來源：http://www.engreen.cn/ |
4樓2015-09-08 11:10:25
5樓2015-09-08 12:54:58
6樓2016-07-29 11:30:50
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