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xiaomili1206新蟲(chóng) (初入文壇)
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siRNA轉(zhuǎn)染常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案 已有4人參與
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1. RNA與轉(zhuǎn)染試劑比例不佳 由于RNA序列差異、合成條件不同以及是否帶有熒光等標(biāo)記，決定了RNA和轉(zhuǎn)染試劑在不同情況下會(huì)有不同的最佳條件，建議先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。 2. 細(xì)胞密度不佳 調(diào)整細(xì)胞密度到轉(zhuǎn)染時(shí)匯合度為20-40%。成功轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生目標(biāo)基因表達(dá)下調(diào)，但未成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞卻不受影響，這時(shí)轉(zhuǎn)染效率和總的細(xì)胞數(shù)量就很重要，一般細(xì)胞數(shù)量較少時(shí)轉(zhuǎn)染效率高。由于siRNA沉默時(shí)效性的影響，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)才能進(jìn)行進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)才能進(jìn)行蛋白檢測(cè)。如果轉(zhuǎn)染時(shí)鋪板密度較高，細(xì)胞一方面轉(zhuǎn)染效果不理想，直接影響沉默效果和數(shù)據(jù)可靠性，另一方面，48小時(shí)甚至更長(zhǎng)時(shí)間后，沉默檢測(cè)最佳點(diǎn)時(shí)，過(guò)于密集的細(xì)胞將影響細(xì)胞狀態(tài)，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 3. RNA效率不高 選擇最優(yōu)RNA，并采用已知高效的RNA做對(duì)照。siRNA的合成需要注意的是一定要選用高純度的siRNA，siRNA的純度直接關(guān)系到轉(zhuǎn)染效率和沉默效率。siRNA的工.。。。。。 原文詳見(jiàn)：http://www.engreen.cn/ |
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2樓2015-08-21 17:19:46
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| 其實(shí)轉(zhuǎn)染RNA挺簡(jiǎn)單的，你可以找專門針對(duì)RNA轉(zhuǎn)染試劑，最好不要用那種DNA和RNA都能轉(zhuǎn)的那種，針對(duì)性不強(qiáng)所以會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。 |
3樓2015-09-08 10:38:18
眾星攬?jiān)?/a>
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siRNA轉(zhuǎn)染常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案 1. RNA與轉(zhuǎn)染試劑比例不佳 由于RNA序列差異、合成條件不同以及是否帶有熒光等標(biāo)記，決定了RNA和轉(zhuǎn)染試劑在不同情況下會(huì)有不同的最佳條件，建議先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。 RNA濃度和轉(zhuǎn)染試劑量的優(yōu)化(24well) 1 2 3 4 RNA工作濃度 25nM 50nM 100nM 150nM 每孔R(shí)NA的量(pmol) 0.17μg (12.5pmol) 0.33μg (25pmol) 0.67μg (50pmol) 1μg (75pmol) 每孔轉(zhuǎn)染試劑量 0.25μl 0.5μl 1μl 1.5μl 2. 細(xì)胞密度不佳 調(diào)整細(xì)胞密度到轉(zhuǎn)染時(shí)匯合度為20-40%。成功轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生目標(biāo)基因表達(dá)下調(diào)，但未成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞卻不受影響，這時(shí)轉(zhuǎn)染效率和總的細(xì)胞數(shù)量就很重要，一般細(xì)胞數(shù)量較少時(shí)轉(zhuǎn)染效率高。由于siRNA沉默時(shí)效性的影響，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)才能進(jìn)行進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)才能進(jìn)行蛋白檢測(cè)。如果轉(zhuǎn)染時(shí)鋪板密度較高，細(xì)胞一方面轉(zhuǎn)染效果不理想，直接影響沉默效果和數(shù)據(jù)可靠性，另一方面，48小時(shí)甚至更長(zhǎng)時(shí)間后，沉默檢測(cè)最佳點(diǎn)時(shí)，過(guò)于密集的細(xì)胞將影響細(xì)胞狀態(tài)，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 3. RNA效率不高 選擇最優(yōu)RNA，并采用已知高效的RNA做對(duì)照。siRNA的合成需要注意的是一定要選用高純度的siRNA，siRNA的純度直接關(guān)系到轉(zhuǎn)染效率和沉默效率。siRNA的工作濃度和siRNA的設(shè)計(jì)、細(xì)胞種類、目標(biāo)基因有關(guān)。建議一定進(jìn)行相關(guān)的預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化各條件。 4. RNA酶污染 建議無(wú)RNA酶和內(nèi)毒素的吸頭、離心管和溶液等材料和實(shí)驗(yàn)器具。 5. 轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)時(shí)間不夠 在mRNA水平可以到48小時(shí)以后驗(yàn)證結(jié)果，在蛋白水平可以到72小時(shí)后驗(yàn)證結(jié)果。siRNA的沉默效果是有時(shí)效性的，在最佳的時(shí)間點(diǎn)觀察，會(huì)得到更加明顯的沉默效果，這個(gè)時(shí)間點(diǎn)的確定不能以同一株細(xì)胞轉(zhuǎn)染DNA的經(jīng)驗(yàn)確定，因?yàn)橐粋�(gè)是消耗mRNA，一個(gè)是產(chǎn)生mRNA。對(duì)轉(zhuǎn)染siRNA，在核酸水平，轉(zhuǎn)染后8-48小時(shí)，即可觀察到mRNA水平的逐步下降，一般來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)通常會(huì)得到漂亮的結(jié)果。 6. 培養(yǎng)基毒性 采用含10-20%血清的全培養(yǎng)基。使用脂質(zhì)體等轉(zhuǎn)染試劑時(shí)，由于含血清轉(zhuǎn)染會(huì)將血清中的蛋白帶入細(xì)胞，引發(fā)細(xì)胞毒性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低，故不能有血清轉(zhuǎn)染。EntransterTM只濃縮包裹核酸不會(huì)將血清帶入細(xì)胞，所以可以有血清轉(zhuǎn)染，同時(shí)由于血清的存在，有利于細(xì)胞的狀態(tài)維護(hù)，故能提高轉(zhuǎn)染效率。 7. 細(xì)胞污染 建議徹底清潔所有細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)用品 原文來(lái)源：http://www.engreen.cn/ |
4樓2015-09-08 11:10:25
尣矢
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5樓2015-09-08 12:54:58
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6樓2016-07-29 11:30:50
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