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無(wú)心之感金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
紫霄洞洞主
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[求助]
分子clone之小白求助篇 已有2人參與
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 本菜鳥(niǎo)最近遇到個(gè)頑固的作死cloning，硬生生死活連不上吶。你到底要鬧哪樣。 此處省略吐槽字樣一千。。進(jìn)入正題： 問(wèn)題描述：準(zhǔn)備構(gòu)建一個(gè)某蛋白定位載體，準(zhǔn)備連接的片段有兩個(gè)：該基因自身的Promoter（長(zhǎng)約2K），Genomic（長(zhǎng)約3K）測(cè)序都沒(méi)問(wèn)題；載體是pCAMBIA1301附帶有EGFP序列（常用的植物表達(dá)載體）。雙酶切回收后，使用T4 liagse（TaKaRa公司的）。反應(yīng)體系如下： T4 liagse....................... 2 ul Promote片段................10ul Genomic 片段................10ul pCAMBIA 1301.............. 4ul T4 buffer...................... 3ul 反應(yīng)溫度: 常溫； 反應(yīng)時(shí)間：4h， 然后轉(zhuǎn)化。 但是。。 問(wèn)題來(lái)了。為嘛它就是連不上捏。。 片段雙酶切回收沒(méi)有問(wèn)題，酶切后1301空載也不長(zhǎng)，說(shuō)明載體已經(jīng)切開(kāi)了。難道是T4酶的問(wèn)題？ 別的我也想不到了。 歡迎來(lái)和我討論幫忙解決問(wèn)題！歡迎提供新的方法（如此最好）！但凡有益，即發(fā)賞賜～  |
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金蟲(chóng) (小有名氣)
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3樓2015-08-26 12:47:19
evangelina
無(wú)蟲(chóng) (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
無(wú)心之感: 金幣+5, ★有幫助, 值得借鑒的方法 2015-08-26 13:47:25
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無(wú)心之感: 金幣+5, ★有幫助, 值得借鑒的方法 2015-08-26 13:47:25
首先看看有沒(méi)有拿錯(cuò)盤(pán)了 有時(shí)糊涂了抗生素用錯(cuò)然后這種三個(gè)片段連的，一般比兩個(gè)片段連的困難一點(diǎn) 我們實(shí)驗(yàn)室一般會(huì)先把兩個(gè)短的室溫連個(gè)2-3小時(shí)，然后把最長(zhǎng)的加進(jìn)去（一般是載體）4度連一晚上 還有可以做個(gè)T4的陽(yáng)性對(duì)照，確保你的酶沒(méi)有問(wèn)題 在或者換個(gè)菌株試試？祝你成功 |
2樓2015-08-26 11:48:36
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