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linnan5945銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
【求助】PBMC怎么都沒東西 已有2人參與
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得先說說我的樣品，比較特殊，人外周血，EDTA抗凝管收集后，將血漿和血細胞分離開，分裝成500ul/凍存管，直接從室溫或冰浴中凍存到-80度，最久的已經(jīng)半年，最近的一個月。 PBMC分離方法： 1、2管血細胞，共1ml血細胞從-80度直接置于37度水�。� 2、1ml血細胞與2ml Hank's（無鈣鎂），輕輕混合均勻； 3、將上述稀釋血溶液，緩慢延壁添加到1.5ml淋巴細胞分離液（購于北京索萊寶公司，200ml，115元）上，有清晰的分層界面； 4、1500rpm，20min（實驗室沒有水平離心機，只有普通離心機，加速度與減速度都是很低的）； 5、發(fā)現(xiàn)分層后的情況是這樣的：第一層，大量的紅色溶液，按理說應該是血漿，但是成紅色，擔心是紅細胞破裂導致；第二層是分離液，量與第一層相當，甚至稍少于第一層；在第一層與第二層之間有一層淺淺的紅色的溶液；第三層是紅細胞，特別少，就只是蓋住離心管底部，在紅細胞上面有一層白色的東西，感覺棉棉的，像白細胞； 6、將第一層，第二層包括兩層中間的那層均另外吸出來，再2500rpm，20min，發(fā)現(xiàn)底部有些絮狀物； 7、吸棄6中的上清，加入5ml Hank's溶液，輕輕混合，1500rpm，10min； 8、重復7； 9、吸棄上清，加入500ul 細胞凍存液，用槍吹打幾次； 10、20ul 0.2%臺盼藍+20ul 9中的細胞懸液，5min后，加到血球計數(shù)板上。 但是結(jié)果是完全沒有，所以我想問題是否有可能是： 1、我的樣品根本沒有辦法做PBMC，可能細胞全部破裂？ 2、紅細胞上面那層白色的棉狀物是否其實就是單核細胞，本應該在再上一層，所以我的離心機是不行的，或者是否可以離心速率再降低到1000rpm？ 3、其他可能性？ 實在很愁啊，都做了2次了，望各位實驗大牛們，幫忙解答~ |
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2樓2015-09-17 18:43:03
yglbuct
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我們就是賣這個的，打個廣告而已 3樓2015-12-22 15:21:09
4樓2016-04-26 11:32:59
濤聲依舊ok
新蟲 (小有名氣)
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5樓2016-06-21 15:56:31
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