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linnan5945銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
【求助】PBMC怎么都沒東西 已有2人參與
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得先說說我的樣品，比較特殊，人外周血，EDTA抗凝管收集后，將血漿和血細(xì)胞分離開，分裝成500ul/凍存管，直接從室溫或冰浴中凍存到-80度，最久的已經(jīng)半年，最近的一個(gè)月。 PBMC分離方法： 1、2管血細(xì)胞，共1ml血細(xì)胞從-80度直接置于37度水浴； 2、1ml血細(xì)胞與2ml Hank's（無鈣鎂），輕輕混合均勻； 3、將上述稀釋血溶液，緩慢延壁添加到1.5ml淋巴細(xì)胞分離液（購于北京索萊寶公司，200ml，115元）上，有清晰的分層界面； 4、1500rpm，20min（實(shí)驗(yàn)室沒有水平離心機(jī)，只有普通離心機(jī)，加速度與減速度都是很低的）； 5、發(fā)現(xiàn)分層后的情況是這樣的：第一層，大量的紅色溶液，按理說應(yīng)該是血漿，但是成紅色，擔(dān)心是紅細(xì)胞破裂導(dǎo)致；第二層是分離液，量與第一層相當(dāng)，甚至稍少于第一層；在第一層與第二層之間有一層淺淺的紅色的溶液；第三層是紅細(xì)胞，特別少，就只是蓋住離心管底部，在紅細(xì)胞上面有一層白色的東西，感覺棉棉的，像白細(xì)胞； 6、將第一層，第二層包括兩層中間的那層均另外吸出來，再2500rpm，20min，發(fā)現(xiàn)底部有些絮狀物； 7、吸棄6中的上清，加入5ml Hank's溶液，輕輕混合，1500rpm，10min； 8、重復(fù)7； 9、吸棄上清，加入500ul 細(xì)胞凍存液，用槍吹打幾次； 10、20ul 0.2%臺(tái)盼藍(lán)+20ul 9中的細(xì)胞懸液，5min后，加到血球計(jì)數(shù)板上。 但是結(jié)果是完全沒有，所以我想問題是否有可能是： 1、我的樣品根本沒有辦法做PBMC，可能細(xì)胞全部破裂？ 2、紅細(xì)胞上面那層白色的棉狀物是否其實(shí)就是單核細(xì)胞，本應(yīng)該在再上一層，所以我的離心機(jī)是不行的，或者是否可以離心速率再降低到1000rpm？ 3、其他可能性？ 實(shí)在很愁啊，都做了2次了，望各位實(shí)驗(yàn)大牛們，幫忙解答~ |
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yglbuct
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3樓2015-12-22 15:21:09
2樓2015-09-17 18:43:03
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4樓2016-04-26 11:32:59
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5樓2016-06-21 15:56:31
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